酸性蛋白酶（acidprotease）是指具有較低最適pH值的蛋白酶，其最適pH值在2.5~5.0之間，在此酸性環境下將蛋白質進行水解，通過內外酶切作用將蛋白質水解為小肽和氨基酸[1].酸性蛋白酶廣泛應用于酒類、食醋及醬油的釀造等方面[2-8].

游離態酶穩定性較差、易失活、不能反復使用，通過固定化酶（immobilizedenzyme）技術可以克服游離酶應用的局限性，把酶束縛在一定空間中或水不溶性載體上，既能限制酶分子的自由流動，又能使酶發揮催化作用[9].

海藻酸鈉（sodiumalginate,SA）因其溫和的凝膠型和無毒性，使它成為最廣泛的固定化材料之一[10-12].以SA作為固定化載體材料存在的缺點是其機械強度不夠大，這可以通過選擇適當的增硬劑來解決[13].阿拉伯膠、卡拉膠、黃原膠均具有良好的機械強度、高內聚力、高穩定性、成膜性等優點，廣泛運用于食品加工、醫藥等領域，與SA復合使用可以增加固定化載體的硬度。

目前已有將無機載體或SA等單一天然膠體作為固定化載體材料進行固定化酸性蛋白酶研究的報道[14-17],而將復合天然高分子膠體作為固定化酸性蛋白酶載體的研究則鮮有報道。本實驗使用SA分別與3 種天然高分子膠體復合制備固定化酶載體吸附酸性蛋白酶，研究復合凝膠濃度、凝膠比例、CaCl2濃度、固化時間、給酶量、吸附時間、酶液pH值等因素對復合膠體固定化酸性蛋白酶酶活回收率的影響。選擇出最優載體進行固定化酸性蛋白酶的制備，對固定化酶的酶學性質進行研究，擬為固定化酸性蛋白酶的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級酸性蛋白酶（酶活力100000U/g） 蘇柯漢生物工程有限公司；食品級海藻酸鈉 青島邁潮海洋科技發展有限公司；食品級阿拉伯膠 艾納提化工科技有限公司；食品級卡拉膠 福建省綠麒食品膠體有限公司；食品級黃原膠 淄博中軒生化有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 游離酸性蛋白酶活力的測定

酸性蛋白酶活力的測定采用Folin-酚法（GB/T23527-2009《蛋白酶制劑》）。酸性蛋白酶活力定義為單位質量的酸性蛋白酶在40 ℃、pH 3.0的條件下，1 min內酶解酪蛋白產生1μg酪氨酸為1 個酶活力單位（U）。

1.2.2 固定化酸性蛋白酶活力的測定

取一定質量的固定化酶測定其酶活力，測定方法與游離酸性蛋白酶的測定方法相同。

1.2.3 相對酶活力及酶活回收率的計算

設定同組酶活力最高的相對酶活力為100%,以同組最高酶活力為參照，計算出的比值為相對酶活力?！?】

1.2.4 固定化酸性蛋白酶的制備方法

以載體溶液總體積30 mL計，設定復合凝膠質量濃度1.8g/100mL,SA與各膠體質量比為1∶1,稱取適量的阿拉伯膠、卡拉膠、黃原膠，分別和SA于60 ℃以下熱水中溶解，混合均勻，超聲波快速消泡至復合凝膠中無氣泡，使用10 mL注射器以約1 滴/s的速率，將復合凝膠滴到質量濃度為4.0g/100mL的CaCl2溶液中，在4 ℃冰箱中固化1.5 h,用紗布濾出載體顆粒，并用緩沖液沖洗3~5 次除去表面的CaCl2.用濾紙吸干表面水分，放入pH 3.0,給酶量1760U/g的酶液中進行吸附，吸附0.5 h后用紗布濾出載體顆粒，用緩沖液清洗，并用濾紙吸干表面的水分。制成的球狀顆粒，即所得的固定化酶，在0~4 ℃條件下保存。

1.2.5 酸性蛋白酶固定化條件的優化設計

1.2.5.1 單因素試驗復合凝膠質量濃度對固定化酶活力的影響測定：復合凝膠質量濃度設定在0.6~2.8g/100mL,每隔0.2g/100mL進行測定，其他因素按照1.2.4節方法制備固定化酶，測定其酶活力。

凝膠比例對固定化酶活力的影響測定：取復合凝膠質量濃度為各復合凝膠最適條件，海藻酸鈉與各膠體質量比例設定為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1,其他因素按照1.2.4節方法制備固定化酶，測定其酶活力。

CaCl2質量濃度對固定化酶活力的影響測定：取各已測指標的最適條件，CaCl2質量濃度設定為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0g/100mL,其他因素按照1.2.4節方法固定化制備酶，測定其酶活力。

固化時間對固定化酶活力的影響測定：取各已測指標的最適條件，固化時間設定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,其他因素按照1.2.4節方法制備固定化酶，測定其酶活力。

吸附時間對固定化酶活力的影響測定：取復合凝膠質量濃度、復合凝膠質量比、CaCl2質量濃度、固化時間最適條件，吸附時間設定為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,其他因素按照1.2.4節方法制備固定化酶，測定其酶活力。

酶液pH值對固定化酶活力的影響：取復合凝膠質量濃度、復合凝膠質量比、CaCl2質量濃度、固化時間、吸附時間均為各復合凝膠最適條件，酶液pH值設定為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5,其他因素按照1.2.4節方法制備固定化酶，測定其酶活力。

給酶量對固定化酶活力的影響測定：取復合凝膠質量濃度、復合凝膠質量比、CaCl2質量濃度、固化時間、吸附時間、酶液pH值最適條件，給酶量設定為1 100、1 320、1 540、1 760、1 980、2 200、2420U/g,按照1.2.4節方法制備固定化酶，測定其酶活力。

1.2.5.2 正交試驗優化固定化工藝在單因素試驗的基礎上，選出對固定化過程影響較大的3 個因素，每個因素設定3 個水平，以酶活回收率作為評價指標，采用L9（33）正交表對固定化條件進行優化試驗。

1.2.6 固定化酸性蛋白酶酶學性質的研究

1.2.6.1 固定化酶的最適反應pH值測定取一定量的固定化酶及游離酶，以質量分數為1%酪蛋白為底物，不同pH值緩沖液中，30 ℃保溫振蕩反應10 min,測定其酶活力。

1.2.6.2 固定化酶的最適作用溫度測定取一定量的固定化酶及游離酶，以1%酪蛋白為底物，不同溫度條件下，pH 3.0緩沖液中保溫振蕩反應10 min,測定其酶活力。

1.2.6.3 固定化酶的熱穩定性測定取一定量的固定化酶及游離酶在無底物的條件下，pH 3.0的緩沖液中，在不同溫度條件下加熱處理30 min后，迅速冷卻。45 ℃條件下，測定其酶活力。

1.2.6.4 固定化酶的動力學性質以米氏常數Km來表示。取一定量的固定化酶及游離酶，在不同底物質量濃度條件下，于45 ℃、pH 3.0緩沖液中保溫振蕩反應10 min,測定其酶活力，采用雙倒數作圖法計算米氏常數Km值。

1.2.7 固定化酶操作半衰期的計算

固定化酶的操作穩定性是最影響使用的關鍵因素。

固定化酶的操作穩定性通常用半衰期表示，即固定化酶活力下降為初始酶活力一半所經歷的連續工作時間。設定酶活力損失同時間成指數關系，半衰期公式可表達為：【2】

2 結果與分析

2.1 載體選擇及固定化條件單因素試驗結果

2.1.1 復合凝膠質量濃度對固定化酶活力的影響【3】

由圖1可知，3 種載體固定化酶活力隨著復合凝膠質量濃度的增大均呈現先增大后降低的趨勢，這是由于當質量濃度過大時載體表面孔隙緊密，不利于酶的吸附。

質量濃度為2.0g/100mL的SA-卡拉膠復合凝膠制成的固定化酶酶活力最高。

2.1.2 復合凝膠質量比對固定化酶活力的影響【4】

由圖2可知，3 種載體固定化酶活力隨著復合凝膠質量比的增大均呈現先增大后降低的趨勢，質量比例為4∶1的SA-卡拉膠復合凝膠制成的固定化酶活力最高。

2.1.3 CaCl2質量濃度對固定化酶活力的影響【5】

由圖3可知，3 種載體固定化酶活力隨著CaCl2質量濃度的增大均呈現先增大后降低的趨勢，這是因為SA與CaCl2的作用是由離子強度所決定，離子強度越強，與SA的作用越明顯；但是當強度過大時，蛋白酶的活力會受到離子強度的影響而降低。質量濃度為4.0g/100mL的SA-黃原膠復合凝膠制成的固定化酶活力最高。

2.1.4 固化時間對固定化酶活力的影響【6】

由圖4可知，固化時間對SA-阿拉伯膠、SA-黃原膠為載體的固定化酶活力影響較大，固化時間為2.5 h的SA-黃原膠復合凝膠制成的固定化酶活力最高。

2.1.5 吸附時間對固定化酶活力的影響【7】

由圖5可知，吸附時間對SA-卡拉膠、SA-黃原膠為載體的2 種固定化酶活力影響較小，吸附時間為2.5 h的SA-黃原膠復合凝膠制成的固定化酶活力最高。

2.1.6 酶液pH值對固定化酶活力的影響【8】

由圖6可知，3 種載體固定化酶活力隨著酶液pH值的增大均呈現先增大后降低的趨勢，酶液pH值為3.5的SA-黃原膠復合凝膠制成的固定化酶活力最高。

2.1.7 給酶量對固定化酶活力的影響【9】

由圖7可知，3 種載體固定化酶活力隨著給酶量的增大均呈現先增大后降低的趨勢，這是由于一定質量的載體可吸附的酶量有限，當載體的吸附酶量達到飽和后繼續增加給酶量反而會影響酶的繼續吸附效果。

給酶量為2200U/g的SA-黃原膠復合凝膠制成的固定化酶活力最高。

2.1.8 正交試驗優化固定化工藝條件

在單因素試驗的基礎上，選出對固定化過程影響較大的3 個因素，每個因素設定3 個水平，以酶活回收率作為評價指標，采用L9（33）正交表對固定化條件進行優化試驗。SA-阿拉伯膠正交試驗選擇因素為復合凝膠質量比、CaCl21擇因素為復合凝膠質量濃度、復合凝膠質量比、CaCl2質量濃度，SA-黃原膠正交試驗選擇因素為復合凝膠質量比、CaCl2質量濃度、固化時間。由表1~3可知，在以酶活回收率為評價指標時，3 種復合載體的固定化酶活回收率理論最優水平分別為A1B2C2、D2A1B3、A3B3C2,影響因素的主次順序分別為B>A>C、D>B>A、C>A>B.3 種載體固定化酶的實際酶活回收率最優水平分別為A1B2C2、D2A1B3、A3B2C3,以SA-阿拉伯膠、SA-卡拉膠為載體的固定化酶的理論優水平與實際優水平一致，其酶活回收率分別為65.34%、48.23%;以SA-黃原膠為載體的固定化酶的理論優水平與實際優水平不一致，因此，通過驗證實驗驗證理論最優組合和實際最優組合中最好的組合以確定最佳固定化條件，驗證實驗結果為理論最優組合A3B3C2酶活回收率為74.12%,實際最優組合A3B2C3酶活回收率為73.07%,確定SA-黃原膠的最佳固化條件為A3B3C2,其酶活回收率為74.12%.綜上，SA-黃原膠的復合凝膠為3 種復合凝膠中固定化酸性蛋白酶的最佳載體，其酶活回收率最高。所以選擇SA-黃原膠復合凝膠為載體材料進行酸性蛋白酶固定化的研究。

2.2 SA-黃原膠為載體的固定化酸性蛋白酶的酶學性質

2.2.1 固定化酸性蛋白酶的最適反應pH值由圖8可知，pH值對固定化酸性蛋白酶及游離酶活性均有較大影響，兩者的活力均隨著pH值的升高呈現先增加后減小的趨勢，在pH 3.0時達到最大值。

2.2.2 固定化酸性蛋白酶的最適作用溫度由圖9可知，溫度對酸性蛋白酶的活力有著顯著影響。隨著溫度的升高，酸性蛋白酶活力隨之增加，但是溫度的不斷升高亦會使酶蛋白逐漸變性，導致酶活力下降。在溫度為45 ℃時，游離酶與固定化酶活力均達到最高，且固定化酶相對活力略高于游離酶。2.2.3 固定化酸性蛋白酶的熱穩定性由圖10可知，在低于40 ℃時，兩種酶的相對活力下降低為緩慢，高于40 ℃后兩種酶活力降低較為明顯，而固定化酶活力降低較游離酶緩慢，表明固定化酸性蛋白酶的熱穩定性明顯高于游離酶。

2.2.4 固定化酸性蛋白酶的動力學性質由圖11可知，固定化酶Km值為18.93mg/mL,大于游離酶Km值（9.98mg/mL），表明固定化酶的底物親和力小于游離酶。

2.2.5 固定化酶的操作半衰期操作半衰期是評價固定化酶是否具有實用性的重要指標，稱取適量固定化酶測其初始酶活力，同時稱取相同質量的固定化酶，以1%酪蛋白為底物進行反應，做2 組重復，每隔2d進行一次測定，根據1.2.7節計算該固定化酶的操作半衰期為17.28d.

固定化酶在經過使用后，酶活力有所下降，這是因為酶經過幾次使用后，某些酶與載體連接不夠緊密，固定在載體表面的酶有部分脫落，但相對游離酶只能使用一次而言，固定化酶的使用效率明顯提高。

3 結論與討論

目前，將固定化技術應用于酸性蛋白酶的研究報道并不多見。Ganesh Kumar等[14]用無機載體活性炭進行酸性蛋白酶的固定化實驗。趙贛[15]、賈莉[16]等使用包埋法將酸性蛋白酶進行固定，苗敬芝等[17]使用包埋-交聯法將酸性蛋白酶與木瓜蛋白酶進行共固定。蛋白質屬于大分子物質，而使用包埋法制備的固定化酶載體會影響酶與大分子底物的接觸效果，所以經包埋法所制成的固定化蛋白酶很難對底物蛋白質起到較好作用[18-19].本實驗選用吸附法進行酸性蛋白酶的固定化實驗，所制得的固定化酸性蛋白酶酶活回收率高于包埋法。

本實驗采用的是物理吸附法，而任琦[20]研究磁性微球吸附牛血清蛋白時得出化學法吸附的PMMA-co-PGMA-CHO微球相較物理方法吸附的PSt-co-PAMPS微球吸附量更大且對蛋白質的影響更小的結論，因此，可以選擇化學吸附法對酸性蛋白酶進行進一步固定化研究。此外，對傳統吸附法進行部分改進或者將吸附法與其他傳統方法進行聯合使用也是固定化蛋白酶方法的發展趨勢[21].

本實驗的載體選擇了3 種天然膠體即阿拉伯膠、卡拉膠、黃原膠與SA混合進行復合凝膠的制備，而每種膠體的物理特性都會有很大差異，因此3 種膠體可能具有一定局限性，在以后的酸性蛋白酶固定化實驗研究中可以選擇更多更廣的食品級天然膠體與SA進行復合凝膠的制備來選擇最佳固定化酸性蛋白酶的載體。

酶的本質是蛋白質，其性質取決于酶蛋白本身特有的高級結構和活性中心基團。固定化過程中所涉及的物理、化學、生物因素以及載體本身都可能引起酶活性中心基團的改變。同時載體的存在也會產生一定的空間位阻和屏蔽作用，這些都有利于酶分子抵御外界環境的變化，因此經固定化處理的酶穩定性通常會較游離酶有所提高[22-23].

本實驗結果表明，以SA-黃原膠為復合載體所制備的固定化酸性蛋白酶相對酶活力最大，為最佳固定化載體材料。其最佳工藝條件為：復合凝膠質量濃度為2.0g/100mL、SA與黃原膠質量比例為6∶1、CaCl2質量濃度5.0g/100mL、固定化時間為2.5 h、吸附時間為2.5 h、酶液pH值為3.5、給酶量2200U/g.固定化酸性蛋白酶酶學性質的研究結果表明：固定化酶的最適pH值為3.0,最適溫度為45 ℃，其熱穩定性明顯優于游離酶，操作半衰期為17.28d.通過擴大實驗可以把固定化酸性蛋白酶應用于酒類、食醋及醬油的釀造等方面。

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