昆蟲的腹神經索\\(ventral nerve cord\\)位于消化道腹面,包括頭部的咽下神經節\\(suboesophageal gangli-on,SOG\\)、胸部\\(胸神經節thoracic ganglia,TG\\)和腹部\\(腹神經節abdominal ganglia,AG\\)的一系列神經節和神經索。體神經節對應于其相應的體節,前后兩端以神經索與相鄰的神經節相連,有相對的獨立性,成為各體節的神經中樞。胸神經節是足和翅的活動中心,并有一定程度的自主調節性。
3齡幼蟲是昆蟲胚后發育過程中的一個重要階段,在這個時期,昆蟲幼蟲的各個組織器官都在快速的生長發育,細胞的有絲分裂活動旺盛,尤其是神經系統內神經細胞的快速分裂增殖,形成了昆蟲幼蟲的神經系統,為后續蛹以及成蟲神經系統的構成打下了結構基礎。關于昆蟲腹神經索胚后發育的特點,國內外的學者進行過一些研究。
Tyrer和Gregory對3種蝗蟲Chortoicetes terminifera、Schistocera gregaria和Locus-ta migratoria咽下神經節和胸部的神經節的神經組織學結構進行了比較研究;Prokop和Technau對果蠅Drosophila melanogaster胚后發育過程中成神經細胞的起源進行了研究;Ito等對果蠅胚胎和幼蟲早期腹神經索神經膠質細胞的類型和發育進行了觀察。本研究通過形態解剖、BrdU免疫組織化學\\(5-bromo-2-de-oxyuridine incorporation,BrdU\\)等技術,對意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼蟲發育中期胸部3個神經節的結構和發育特點進行了研究,為昆蟲神經系統的結構及發育特征的研究提供一定的理論證據。
1、材料與方法
1.1實驗材料
實驗所用的意大利蜜蜂幼蟲、蛹均購自秦嶺灃峪蜜蜂養殖戶,所取材料均來自同一蜂群。幼蟲\\(larva,L\\)共5齡\\(L1"L5\\),根據戴氏定律\\(Dyar's law\\),每一頭幼蟲的齡期通過測量頭殼的寬度來決定;蛹\\(pupa,P\\)期約9d\\(P1"P9\\)。
1.2研究方法
1.2.1組織化學意大利蜜蜂工蜂的幼蟲和蛹多聚甲醛4℃固定過夜。梯度酒精脫水,二甲苯透明。石蠟包埋,橫向或縱向連續切片,切片厚度5#7μm,切片裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,烘干備用。切片脫蠟后復水,HE染色,OLYMPUS\\(BX51\\)顯微鏡觀察拍照。
1.2.2 BrdU摻入處理對取得的蜜蜂幼蟲和蛹的活體,從腹部注射約3μL濃度為25mg/mL的BrdU\\(B9002,Sigma\\)。
1.2.3 BrdU免疫組織化學染色將BrdU處理過的1-5齡幼蟲和1"8d蛹各3#5頭,4%多聚甲醛4℃固定8h。70%,80%,90%,95%和100%梯度酒精脫水,石蠟包埋,橫向連續切片,厚度為7μm。切片裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,烘干備用。
切片用二甲苯脫蠟,入梯度酒精復水;抗原修復,PBS洗3次;3%過氧化氫封閉內源性酶10min,TBS洗3次;滴加正常山羊血清封閉液,37℃30min;滴加小鼠BrdU單克隆抗體\\(1/200\\)\\(ab8039,ABCAM\\),濕盒中4℃孵育過夜,PBS洗3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃120min,PBS洗3次;滴加過氧化物酶37℃孵育30min,PBS洗3次;DAB顯色后鏡檢,中性樹膠封片,Nikon數碼顯微成像系統\\(DS-5M\\)拍照。陰性對照以PBS代替一抗。
2、結果
意大利蜜蜂在3齡幼蟲階段,胸部具有3個獨立的神經節\\(圖版:A,B,C\\)。在每一個神經節的側面和腹面靠近邊緣的位置,能看到大的成神經細胞\\(neuroblast,NB\\),直徑約1.6±0.3μm,它們通過不對稱的細胞分裂方式形成的神經節母細胞\\(ganglion mother cells,GMCs\\)。GMCs排列成串,朝向神經纖維網的方向\\(圖版:D,E\\)。BrdU標記顯示,在這個時期細胞的分裂活動并不活躍,只在神經纖維網周圍以及神經節周圍有少數的神經膠質細胞處于分裂階段\\(圖版:F,G\\);此外,在成神經細胞周圍,能看到極少數的神經節母細胞正在分裂\\(圖版:G\\)。到蛹發育的第5天\\(P5\\),胸神經節的發育基本完成,神經纖維網占據了神經節的大部分,少量的神經細胞聚集在它們的周圍\\(圖版:H\\)。胸部的第2個神經節\\(TG2\\)已由中胸、后胸和腹部的前兩個神經節合并形成,位于中胸與后胸之間\\(圖版:I\\)。
3、結論和討論
3.1不同昆蟲種類神經節的結構和胚后發育比較
在低等的昆蟲種類,如纓翅目、有翅亞綱較低等類群以及很多完全變態昆蟲的幼蟲期,其胸腹部可見到11對神經節,即胸部3對,腹部8對。一些進化的類群和很多完全變態類昆蟲的成蟲,胸、腹部的神經節常有不同程度的合并現象。在意大利蜜蜂的幼蟲發育階段,胸部和腹部的神經節沒有愈合,共11對,每個神經節在幼蟲早期各自獨立,并且發育情況相似。但是到了蛹發育階段,一些神經節逐漸發生愈合,到蛹發育的第5天以后,明顯可見7對神經節,其中2對位于胸部,另外5對位于腹部。胸部第1個神經節\\(TG1\\)位于前胸,支配胸部第一對足的活動。第2個神經節\\(TG2\\)較大,由中胸、后胸和腹部的前兩個神經節合并形成,位于中胸與后胸之間,該神經節發出的神經控制此區域的足、翅和肌肉等組織器官的活動。家蠶Bom-byx mori胸腹部神經節的愈合也發生在蛹期,在蛹發育早期,胸神經節TG1和TG2同腹神經節AG1和AG2融合,腹神經節AG6和AG7/8融合,到蛹發育的第4天以后融合完成。
在昆蟲神經系統的發育過程中,細胞的增殖模式主要有2種:一是大型的成神經細胞通過不對稱的細胞分裂方式增殖自己并產生小的神經節母細胞\\(GMCs\\);二是神經節母細胞通過循環的對稱分裂產生神經細胞,這2種細胞增殖方式在意大利蜜蜂腹神經索的發育過程中都能看到。
BrdU標記顯示,在意大利蜜蜂3齡幼蟲每一個神經節的側面和腹面靠近邊緣的位置,都能看到大的成神經細胞,它們的直徑在1.6±0.3μm。這些成神經細胞通過不對稱的細胞分裂方式形成神經節母細胞,GMCs排列成串,朝向神經纖維網的方向。隨后,GMCs經過對稱分裂的方式快速增殖,并最終形成神經節中所有的神經細胞和神經膠質細胞。
這樣的神經細胞增殖方式在中華蜜蜂腦部神經系統的胚后發育過程中也同樣能夠看到。就咽下神經節和胸神經節的組織結構和胚后發育特點來看,它們在幼蟲發育階段非常相似,幾乎無法區分,但是胸神經節的增加比率明顯快于咽下神經節。在幼蟲發育早期時,咽下神經節所占的比例大于胸神經節,其成神經細胞的體積\\(直徑約2.5±0.2μm\\)[9]
也明顯大于胸神經節\\(直徑約1.6±0.3μm\\)。但是在變態發育時,胸神經節的體積很快超過了咽下神經節,這可能是由于咽下神經節在幼蟲早期就具有生理功能,所以它在孵化時比胸神經節更加成熟的緣故。
3.2蜜蜂腹神經索的神經膠質
Ito等通過對果蠅胚胎和幼蟲早期腹神經索神經膠質細胞的類型和發育的觀察,將其分為3大類6種類型:\\(1\\)表面神經膠質\\(surface-associated glia\\),包括亞神經鞘神經膠質\\(subperineurial glial cells,SPG\\)和通道神經膠質\\(channel glial cells,CG\\);\\(2\\)皮層神經膠質\\(cortex-associated glia\\),包括細胞體神經膠質\\(cellbody glial cells,CBG\\);\\(3\\)神經纖維網神經膠質\\(neuropile-associated glia\\),包括神經根神經膠質\\(nerveroot glial cells,NG\\),界面神經膠質\\(interface glial cells,IG\\)和中線神經膠質\\(midline glial cells,MG\\)。表面神經膠質、皮層神經膠質和神經纖維網神經膠質作為昆蟲神經系統中神經膠質的3大類群,在許多昆蟲中都存在,這已經得到證實,但是關于其下類群的分類方法,現在還存在爭議。
對意大利蜜蜂腹神經索中神經膠質的形態和位置的觀察表明,3種類型的神經膠質在意大利蜜蜂的腹神經索中都存在。在意大利蜜蜂3齡幼蟲的腹神經節的邊緣,能夠看到亞神經鞘神經膠質\\(SPG\\),它們的細胞體呈四方形,胞核大而圓,細胞整齊地排列在神經節的周圍;到蛹期,有些細胞變成扁平形。
SPGs的細胞質有時會延伸短的突起進入皮層,填充外圍神經細胞體之間的空隙。SPGs與神經圍膜一起構成昆蟲中樞神經系統與周圍體液之間的物質交換屏障。在果蠅幼蟲的神經節中,SPGs的數量遠少于蜜蜂,每個神經節中只有16個。
在蜜蜂3齡幼蟲的腹神經索中,能夠觀察到皮層神經膠質中的細胞體神經膠質\\(CBG\\)。同果蠅類似,CBGs在皮層中的位置非常顯著,它們的細胞核和細胞體非常不規則,細胞質延伸突起充滿相鄰的神經元細胞體之間的空隙。CBGs主要的作用是為神經元細胞體提供營養、支持以及空間約束。
在神經纖維網神經膠質的3種類型中,我們只觀察到了界面神經膠質\\(IG\\),它們也被稱為鞘狀神經膠質\\(ensheathing glia\\)。界面神經膠質位于皮層和神經纖維網的分界面,其胞核是細長的橢圓體,IGs常發出突起包圍神經纖維網。因為沒有特殊的標記,所以在蜜蜂的腹神經索中通道神經膠質、神經根神經膠質\\(NG\\)和中線神經膠質\\(MG\\)無法辨識。
參考文獻：
[1] 彩萬志,龐雄飛,花保禎,梁廣文,宋敦倫.普通昆蟲學[M].北京:中國農業大學出版社,2001.
