酪氨酸是維持細胞生長必備的氨基酸之一，而丙酪二肽作為一種新型培養基的組成成分，其合成方法多為酶促合肽[1-3],雖然反應效率較高，但由于酶的專一性和成本較高，不利于工業化。本文設計用甲醇保護的 L-酪氨酸和氯甲酸芐酯保護的丙氨酸反應生成帶保護基團的二肽，再通過堿解和加氫脫去保護基團，合成路線見圖 1,該方法反應條件溫和，原材料價格低廉，具有一定的工業化價值。
1、試驗部分
1.1 試驗試劑與儀器。
試劑：L-丙氨酸和 L-酪氨酸，1-羥基苯并三氮唑 （HOBt），1-乙基 -（3-二甲基氨基丙基 ） 碳酰二亞胺鹽酸鹽 （EDC-HCl），純凈水為飲用水，其余試劑均為市售工業試劑。
儀器：LC-10ATVP 液相色譜儀測定，TENSOR27 型傅里葉變換紅外光譜儀 （KBr 壓片 ），LC-MS-2010EV 質譜儀，Avanceav 500 型核磁共振儀 （CDCl3溶劑，TMS 內標 ）。
1.2 實驗步驟。
1.2.1 酪氨酸甲酯鹽酸鹽 2 的制備。
向 1L 體系中加入甲醇 600mL,冰鹽浴降溫至T<0℃，緩慢滴加氯化亞砜31.6g,控溫T<0℃反應，滴畢，向體系加入 L-酪氨酸 40g,繼續攪拌，撤去冰鹽浴，緩慢加熱至回流 2h,降溫至T< 50℃，減壓濃縮得黃色粗品 82g;甲醇 / 甲基叔丁基醚重結晶，得白色固體 42g,收率 82%,LC 純度 99%.
1.2.2 Cbz 保護丙氨酸 3 的制備。
向 2L 體系中加入 L-丙氨酸 89.0g,12% 氫氧化鈉溶液 900mL,冰鹽浴降溫至體系T< 0℃，緩慢滴加氯甲酸芐酯 340g,滴畢自然升溫至室溫反應，不斷補充氫氧化鈉溶液，保持體系 pH ≈ 12 反應，至pH 無變化，緩慢加入 18% 鹽酸溶液至 pH ≈ 8,加入乙酸乙酯洗滌水相至澄清，繼續緩慢加入 18% 鹽酸溶液至體系 pH < 1,乙酸乙酯 1200mL 提取水相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得白色粗品300g;乙酸乙酯 / 石油醚重結晶得白色固體 182g,收率 81%,LC 純度 94%,ESI-MS（m/z）：（222,M--H）。
1.2.3 Cbz 保護丙氨酰酪氨酸甲酯 4 的制備。
向 1L 體系中加入酪氨酸甲酯鹽酸鹽 39.3g,Cbz保護丙氨酸 45.0g,HOBt 32.4g,四氫呋喃 750mL,冰鹽浴降溫至體系T< -5℃，緩慢滴加三乙胺 20.2g,滴畢，控溫T< 0℃繼續攪拌 30min,加入 EDCl45.8g 控溫T< 0℃反應，繼續攪拌 30min,撤去冰鹽浴，自然升溫至室溫反應，體系中少量固體不溶，繼續攪拌 16h,濃縮反應液得黃色粘稠固體 80g,溶入乙酸乙酯 800mL,分別用飽和碳酸氫鈉溶液和0.5mol/L鹽酸溶液分次洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮得淺黃色粗品 70g;乙酸乙酯 / 石油醚重結晶得白色固體 55g,收率 80%,LC 純度 96%,ESI-MS（m/z）：401, M+ + H）。
1.2.4 脫甲酯保護中間體 5 的制備。
向 500mL 體系中加入 Cbz 保護丙氨酰酪氨酸甲酯 35g,甲醇 350mL,加熱至 40℃溶清，冷卻至室溫，緩慢滴加 2mol/L氫氧化鈉溶液 220mL,滴畢，繼續攪拌 1h,緩慢加入 2mol/L鹽酸溶液調節體系 pH=8~9,濃縮除去甲醇，向剩余水液加入2mol/L鹽酸溶液調節體系pH<1,乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮得白色粘稠物 35g,收率 90%,LC 純度 91 %,ESI-MS（m/z）：（387,M+ + H）。
1.2.5 L-丙氨酰-L-酪氨酸 1 的制備。
向 500mL 體系中加入脫甲酯保護中間體 522.0g,10% Pd/C 4.4g,甲醇和水的混合液 920mL,通H2（ 約 0.1MPa） 反應 2h,過濾除去 Pd/C,濾液減壓濃縮得白色粗品 20g,甲醇和純凈水分別打漿 30min,過濾，得白色固體 17g,收率 77%,LC 純度 99%.
1.3 產品鑒定。
產品為白色晶體粉末，紅外圖譜如圖 2 所示，與分子結構相符；ESI-MS（m/z）：（253,M+ + H）；1NMR（D2O,500MHz），δ：7.1（d,2H）；6.8（d,2H）；4.4（m,1H）；4.0（q,1H）；3.1（dd,1H）；2.9（dd,1H）；1.5（d,3H）。
2、結論
本文所用氨基酸保護基材料低廉，合肽采用EDCl-HOBt 體系，后處理純化方法簡單且收率較高；加氫脫保護時用甲醇 / 水混合體系替代原有的單一溶劑體系，有效避免反應過程中產物析出附著 Pd/C催化劑導致其失活，優化后的反應體系加氫時間僅為 2h（常溫 20~30℃反應），反應完畢經簡單后處理純度即可達 LC > 99%.該合肽方法條件溫和，具有一定的工業化意義。
【參考文獻】
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