【摘要】 目的 運用低強度脈沖場超聲（LIPUS）刺激促進人脂肪間充質干細胞（hASCs）增殖，為臨床干細胞體外高效增殖提供新方法。方法 通過LIPUS體外刺激hASCs細胞生長，采用Scepter 2.0手持細胞計數器進行細胞計數，運用熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態，運用流式細胞儀檢測細胞表面標志物，并進行干細胞臨床前質量檢測。結果 刺激組50 mW/cm2和60 mW/cm2的LIPUS刺激強度均能促進細胞增殖，60 mW/cm2強度更顯著，與對照組比較差異均具有統計學意義（P<0.05）；細胞倍增時間比對照組縮短，差異具有統計學意義（P<0.05），刺激后刺激組細胞表面標志物無變化，增殖后干細胞質量檢測符合標準要求。結論 LIPUS刺激可促進hASCs有效增殖，低強度脈沖場超聲可作為干細胞體外擴增的新方法。

【關鍵詞】 低強度脈沖場超聲；人脂肪間充質干細胞；細胞增殖；質量檢測。

低強度脈沖場超聲（low-intensity pulsed ultra-sound,LIPUS）作為高頻、小振幅和脈沖壓力波傳遞機械刺激經皮進入生物組織的一種非侵入性的治療方式[1]
,目前被廣泛應用于臨床治療。有報道，LIPUS刺激既促進細胞DNA和蛋白質合成[2],又促進細胞對鈣的吸收[3].LIPUS亦可提高細胞活性、細胞因子釋放、基因表達、礦化率、Akt 信號、鉀流動、血管生成、腺苷酸環化酶活性和TGF-β合成的影響等[4-6],對再生醫學具有重要意義。

脂肪間充質干細胞（adipose tissue-derived mesen-chymal stem cells,ASCs）由于其來源廣、且容易獲得等特點，已經成為新一代組織工程種子細胞的來源之一。隨著近年來干細胞研究領域的快速發展，人們對干細胞生物學的了解越來越深入。人脂肪間充質干細胞（hASCs）因具有低的免疫原性和強大的免疫調節特性，被用于同種異體的細胞移植等，治療多種疾病和組織損傷[7-8],促進了干細胞移植和再生醫學的發展。

LIPUS促進體內組織的修復，那么它應先促進體內細胞增殖然后再作用于損傷部位。然而，以往的研究者未見運用LIPUS對hASCs細胞增殖的研究，且促進細胞增殖機制未明確。本實驗中，我們運用LIPUS刺激促進hASCs增殖，增殖后干細胞質量檢驗符合要求，實驗結果為hASCs體外高效擴增和產業化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源
人脂肪間充質干細胞購自廣州賽業生物科技有限公司，按標準操作進行培養和傳代[9-11].

1.1.2 儀器和試劑
人脂肪間充質干細胞完全培養基（廣州賽業生物科技有限公司）；0.25%胰酶消化液（Gibco 公司）；流式抗體 CD105-PE、CD73-PE、CD34-PE、CD14-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE和HLA-ABC-PE （廣州BD 公司）；支原體培養和鑒定藥敏檢測試劑盒（中山市天祥電子生物傳感器有限公司）；實時定量PCR法檢試劑盒（中山達安基因檢測有限公司）；細菌內毒素檢查試劑盒（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）；快速革蘭氏染色試劑盒（珠海貝索生物技術有限公司）；細胞培養皿、12孔板、50 mL離心管（Grenier公司）；手持細胞計數儀（Merck Millipore 公司）；細胞擴增儀 SonaCell（加拿大 Intelligent-Nano 公司）；細胞培養箱（美國 Ther-mo）；實時定量 PCR 儀（瑞士羅氏公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 SonaCell
細胞擴增儀 LIPUS 刺激 Sona-Cell （Jie Chen 提供）超聲設備是基于生物學和臨床研究的基礎上設置的：超聲頻率為1.5 MHz,脈沖重復頻率為1 kHz,脈沖循環為20%.超聲平均強度可調整在0~100 mW/cm2.儀器探頭通過耦合劑緊貼培養皿底部進行輻照，本實驗選用SonaCell細胞擴增儀40 mW/cm2、50 mW/cm2、60 mW/cm2強度的LIPUS刺激[12]為刺激組，0 mW/cm2強度為對照組。取hASCs第3代細胞2×104個的密度1 mL接種于12孔板相應的孔中，細胞培養24 h后換液，然后使用SonaCell設備的LIPUS刺激部件于細胞培養箱中刺激，5 min/d,連續刺激4d （即細胞培養24 h、48 h、72 h、96 h），第5天收集細胞并計數。細胞倍增時間（population doubling time,PDT）計算方法：t=T/3.32 （lgN2-lgN1），T為對數期的持續增長時間，N1和N2分別是對數增長開始和結束的細胞數量。做5組重復實驗，對數據進行統計學分析。

1.2.2 細胞計數
運用 Scepter 2.0 手持細胞計數器進行細胞計數，用0.25%胰酶-EDTA消化液消化并收集細胞，用適量的D-PBS重懸細胞，取150 ?L細胞懸液至1.5 mL離心管中，使用Scepter 2.0計數器的60 ?L感應探頭插入液面以下。根據制造商的說明書進行操作。使用Scepter Software Pro軟件進行數據分析，準確測量細胞的直徑和每毫升體積內細胞的數量。

1.2.3 細胞形態觀察
由于細胞生長至第 5 天（120 h）后，顯微鏡下觀察不好分辨細胞的數量。本實驗選擇第2次刺激后12 h （即細胞培養60 h），對數生長期初始階段，將刺激組和對照組細胞置于倒置顯微鏡下觀察，運用Image-Pro Plus軟件拍照。

1.2.4 hASCs
免疫表型測定 通過流式細胞儀測定hASCs 刺激組與對照組表面標記物CD105、CD73、CD34、CD14、CD45、HLA-DR 和 HLA-ABC 的表達情況。取消化待測細胞，用D-PBS緩沖液清洗兩次。調整細胞濃度為3×105個/mL,加入適量熒光標記的單克隆抗體，室溫，避光孵育30 min.再清洗一次，重懸，上機檢測，運用BD FACSDIVA軟件進行分析。

1.2.5 取第 3 代刺激后 hASCs 進行無菌試驗、支原體檢測、內毒素檢測、革蘭氏染色、人源特定病毒檢測
參照《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》和《中華人民共和國藥典》2010 年版三部附錄進行[13-14].

1.3 統計學方法
應用 SPSS20.0 統計學軟件包進行數據分析，采用GraphPad Prism6 軟件作圖。首先對數據行正態性檢驗，若不符合正態分布，通過正態性轉換后再下一步處理。組內比較采用One-wayANOVA 檢驗方法，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 LIPUS 刺激促進 hASCs 體外增殖 LIPUS刺激 hASCs 體外增殖，第 5 天計數結果顯示刺激組50 mW/cm2和60 mW/cm2強度都有促進細胞增殖的效果，其中60 mW/cm2刺激強度最明顯，細胞倍增時間較對照組縮短，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖1和圖2.