前言

細胞生物學研究中，科研人員的常用研究方法是利用染料標記細胞或細胞內功能區，并通過熒光顯微、共聚焦成像等方法分析細胞結構形態與功能、通過探針熒光強度統計方法分類細胞[1,2].這些方法的共性是通過檢測特異性染料發出波長的種類與強度區分細胞種類和功能[3].可檢測的熒光參數通道越多，可分析的熒光探針種類越多，就越有助于實驗中對細胞進行細致的分析[4].因此衡量研究系統功能豐富與否的直觀手段是其支持光源與熒光參數種類的多少。為了實現熒光波長參數的有效區分與探測，上述系統結構中通常都包含濾光結構以實現光源波長以及熒光探測通道的選擇。常用的濾光結構包括：D由不同種類的長通、短通和帶通濾光片組合搭配構成濾光結構。2）由具備光色散能力的元件如光柵、棱鏡等構成濾光結構。3）由可調諧波長選擇元件，如聲光可調諧濾波器或液晶可調諧濾波器構成濾光結構。其中，聲光可調諧濾波器是近年來發展的，基于聲光相互作用原理實現波長選擇的新型濾光器件，具有無機械結構、波長分辨率高、微秒級響應、孔徑角較大等優點[5].為了深入了解聲光可調諧濾波器特性，充分發揮其在高光譜成像、細胞分類識別系統中微秒級波長選擇與功率調制功能。本文從應用的角度出發，歸納總結了 2 種主要應用模型，探討了系統采用聲光可調諧后在光譜分辨能力和細胞功能識別方面的技術優勢。

1 聲光可調諧濾波器的原理結構與技術指標

聲光相互作用現象于 1930 年被美國的 Debye and Sears 首次報道，直至 1975 年非共線聲光濾波器首次出現，因性能的極大提高而得到廣泛應用[6].目前，聲光可調諧濾波器（Acous-to-Optic Tunable Filter ,簡稱 AOTF）器件的作用范圍可以覆蓋可見光到短波紅外區域[7].構成 AOTF 器件最常見的聲光晶體材料是二氧化碲晶體或石英晶體。

1.1 聲光可調諧濾波器原理結構

聲光可調諧濾波器通常由聲光晶體、換能器、吸收介質、射頻源組成。其功能是從復色輸入光中分離與射頻源輸入信號頻率高度相關的單色光。

AOTF 技術依賴于超聲波與光波在聲光晶體中的共同傳播，其作用類型包括共線型與非共線型。常用的聲光可調諧濾波器為非共線型，即聲波和光波以不同角度傳播通過晶體。晶體的一側通常連接超聲換能器將射頻源的輸入信號轉化為超聲波。當聲波穿過聲光晶體時導致晶格交替壓縮與放松，發生折射率調制現象，相當于晶體中形成了光柵，并隨著聲波的傳播而在晶體中移動。與聲波交叉傳播的光波通過上述折射率調制區域后發生聲光衍射現象。光在聲光晶體中的傳播特性不同于傳統衍射光柵，因此 AOTF 只衍射特定波長的光且波長與輸入射頻頻率高度相關。由于偏振方向差異，衍射光將形成兩個一級衍射光束，被稱為 +1 級光和 -1 級光，聲光可調諧濾波器原理如圖 1 所示。實驗裝置中通常應用光闌阻止其中的一級而利用另一級光束。

1.2 聲光可調諧濾波器的技術指標

描述聲光可調諧濾波器性能最重要的參數包括：聲光可調諧濾波器中心波長選擇能力和光譜分辨率等[5].

聲光可調諧濾波器中被選擇單色光的波長是施加于聲光晶體上超聲頻率的函數。因此，通過改變聲波頻率，可以改變偏轉分離的單色光中心波長。中心波長 與聲波頻率 的關系是

2 聲光可調諧濾波器的細胞生物學應用

2.1 聲光可調諧濾波器的細胞生物學應用模型

由于聲光可調諧濾波器具有響應速度快、波長選擇能力強的特點而得以廣泛應用。按照聲光可調諧濾波器在系統中功能的不同，應用模型主要分為兩類。一是將 AOTF 應用于熒光的激發光源端，實現光源波長的選通和功率調制。光源發射的光經聲光可調諧濾波器選擇特定波長后用于樣本激發，避免了光源較廣泛的發射光譜作用于熒光染料而產生相互干擾。較簡單的應用實例是 AOTF 用于氬離子激光器 488 nm、514 nm 兩條譜線的選擇輸出。另一類主要應用是將 AOTF 應用于目標熒光染料波長的檢測端，作為光譜濾波器實現多光譜應用或指紋光譜測量。兩種應用的原理模型示意圖如圖 2、3:

2.2 聲光可調諧濾波器光源端應用

光源是細胞生物學研究系統中常用組件，根據使用功能的不同如：照明、激發、燒蝕等選擇不同的光源種類。共聚焦、多光子顯微術、光鑷、流式細胞術等技術推動了光源性能的高速發展，提出了新的應用需求。目前，激光器已在較廣的應用領域中替代了傳統的汞燈、氘燈、鹵素燈等，但是單激光器波長固定，往往難于滿足復雜使用條件下對光源波長的需求。應用 AOTF搭配高功率汞燈實現線狀譜選通較好的解決了照明中波長變換的要求，但能量利用率偏低，且難于達到更高的光功率密度。

超連續光源的出現是光源發展歷程中的一大重要進步，配合AOTF 系統可實現光源光譜范圍內連續的波長選擇，同時具備百兆級的重復頻率，可部分替代鈦寶石激光器，滿足雙光子和二次諧波顯微系統中的應用。Brimrose 公司提供的連續可調光源系統波長選擇范圍是 450-650 nm,波長分辨率可達 2 nm.

Fianium 公司提供的超連續光纖激光光源的輸出波長范圍覆蓋480-2400 nm,可見波段的功率密度平均值大于 5 mw/nm[8].配合 8 通道 AOTF 系統實現了輸出波長與熒光染料吸收峰的精密匹配，可獲得更高的信噪比，實現微弱表達細胞的檢測。與之相似，NKT Photonics 公司也提供了可與超連續光源匹配的聲光可調諧濾光系統，通過雙波段的晶體配合實現了最高通道數可達 16 通道的高速調制光源。法國 Nelly Rongeat 等研究人員利用 AOTF 光源系統高速調制光功率，恰當控制由 491 nm 和561 nm 雙波長激發偶聯了抗 CD20 和抗 CRTH2 的 PE-cy5 與噻唑橙染料的熒光激發強度，實現常規實驗中因表達微弱難于測定的嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞的識別分析，獲得了較傳統細胞計數儀器更高信噪比[9].