腸神經嵴干細胞\\(enteric neural crest stem cells,ENCSCs\\)來源于迷走神經嵴\\(vagal crest,VC\\)和骶神經嵴\\(sacral crest,SC\\).VC 來源的 ENCSCs 定植于整個消化道,構成腸神經系統的絕大部分腸神經節.該過程發生障礙,將造成腸道不同部位缺乏神經節細胞,局部腸管痙攣和狹窄,近端腸管代償擴大,從而導致先天性巨結腸的發生[1].先天性巨結腸的發病率高達1 /5 000 ~ 1 /2 000,是嚴重影響兒童健康的先天性疾病.神經嵴干細胞遷徙的啟動需骨形態發生蛋白\\(bone morphogenetic proteins,BMPs\\)的參與[2].研究發現,膠質細胞源性神經營養因子 \\(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF\\) 與受體 RET 結合可激活存活的信號通路,而 GDNF 缺失會誘導細胞凋亡[3].目前骨形態發生蛋白 2 \\(bone morphogeneticprotein 2,BMP2\\) 、GDNF 在 ENCSCs 增殖及遷移中的作用尚無定論.本研究采用機械分離法和酶消化法從胎鼠腸道組織獲取 ENCSCs,使用免疫熒光技術對其干細胞特性和多向分化能力進行鑒定,探討 BMP2 及GDNF 對體外培養 ENCSCs 增殖、遷移的影響,闡明BMP 信號通路在先天性巨結腸發生、發展過程中可能參與的分子機制,旨在為先天性巨結腸的病因診斷及治療提供實驗室依據.

1 材料與方法

1. 1 試驗動物

孕13. 5 d 清潔級 SD 大鼠共20 只\\(體質量220 ~250 g\\),由重慶醫科大學實驗動物中心[許可證號:SCXK\\(渝\\) 2007-0001]提供.

1. 2 儀器與試劑

細胞培養主要儀器:ESPEC 恒溫 CO2培養箱和 Olympus 倒置顯微鏡.DMEM/F12 完全培養基\\(Sigma 公司\\)組成:B27 添加劑、N2 添加劑、重組人堿性成纖維細胞生長因子\\(bFGF\\)、表皮生長因子\\(EGF,Abcam 公司\\),青霉素和鏈霉素\\(華北制藥\\).

促分化培養基組成:DMEM/F12 完全培養基添加 10% \\(體積比\\)胎牛血清.其他:胰蛋白酶、Ⅳ型膠原酶、左旋多聚賴氨酸\\(Sigma 公司\\) .一抗:兔抗鼠 NGFRp75、兔抗 Nestin 多克隆抗體、兔抗 GFAP、兔抗 SMAα、兔抗 TUJ1\\(Abcam 公司\\),FITC 標記抗鼠 CD49d、PE 標記抗鼠 P75\\(Biolegend 公司\\),細胞因子BMP2、GDNF\\( PeproTech 公司\\) .

1. 3 方法

1. 3. 1 細胞分離培養 取孕 13. 5 d SD 大鼠腹腔注射 10%水合氯醛 15 mL/kg,麻醉顯效后常規消毒剖腹取胎鼠.解剖顯微鏡下取出胎鼠腸道組織,小心去掉腸管漿膜層及周圍結締組織,然后將剩余部分盡可能剪碎.0. 25%胰酶與 1. 0 mg/mL 膠原酶分別在37 ℃恒溫搖床中消化10 min 和20 min,400 目篩網過濾,1 000 r/min 離心 5 min.取沉淀,DMEM/F12 重懸,制成單細胞懸液.1 000 r/min 離心 5 min,棄去上清.沉淀中加入ENCSCs 培養基重懸,吹打均勻,細胞計數并調整細胞密度\\(1 ~2\\) × 106/ mL 接種到纖維素\\(2μg/cm2\\)預包被的一次性培養瓶中,37 ℃,5% CO2孵箱培養.每隔 2 d 半量換液 1 次.細胞培養第 1 天開始,每天定時于光學顯微鏡下觀察所培養細胞形態變化并拍照.

1. 3. 2 ENCSCs 鑒定 采用免疫熒光法對傳代培養的干細胞進行 P75、Nestin、TUJ1、GFAP、α-SMA 標記染色,對所獲得細胞的干性及多向分化能力進行鑒定.

1. 4 BMP2、GDNF 對原代培養 ENCSCs 的調控作用

1. 4. 1 BMP2 對 ENCSCs 增殖能力的影響 獲得的 ENCSCs分散后調整細胞數為\\(1 ~ 2\\) × 106/ mL,分別接種于含不同濃度細胞因子 BMP2\\(10 ~ 120 ng/mL\\)培養基中,37 ℃,5% CO2孵箱中培養,每隔 1 d 半量換液 1 次,培養 1 周后,計數不同處理組細胞成球率[4],觀察不同濃度 BMP2 對 ENCSCs 增殖能力的影響.

成球率 = \\(細胞球數/接種細胞數\\) ×100%1. 4. 2 GDNF 與 BMP2 對 ENCSCs 增殖能力的影響 獲得的 ENCSCs 分散后調整細胞數為\\(1 ~2\\) ×106/ mL,根據是否加入細胞因子 BMP2 和/或 GDNF 分組:對照組\\(ENCSCs 單獨培養組\\)、ENCSCs + GDNF 100 ng/mL 組、ENCSCs + BMP2 50 ng/mL組、ENCSCs +BMP2 50 ng/mL + GDNF 100 ng/mL 組.不同處理組細胞于 37 ℃,5% CO2孵箱中培養,每隔 1 d 半量換液 1 次,于培養第 2、4、6 天分別收集細胞,計數不同處理組干細胞成球率,觀察不同處理組 ENCSCs 增殖能力的影響,每組重復 3 次.

1. 4. 3 GDNF 與 BMP2 對 ENCSCs 遷移能力的影響 根據Hotta 等[5]研究 ENCSCs 遷移的方法并進行改良.取交媾后13. 5 d 胎鼠中腸腸片 200 ~ 300 μm,包埋于含預先配置好的三維立體培養基的 24 孔板中\\(每孔含鼠尾膠 10 mg,0. 2%冰醋酸2. 5 mL,0. 8 mol/L 碳酸氫鈉 100μL,200 mmol/L 氫氧化鈉70 μL,DMEM/F12 7.3 mL\\).根據是否加入細胞因子 BMP2 或/和 GDNF 分組:對照組\\(腸片單獨培養\\)、腸片 + GDNF 100 ng/mL組、腸片 + BMP2 50 ng/mL 組、腸片 + BMP2 50 ng/mL + GDNF100 ng / mL 組,不同處理組于 37 ℃ ,5% CO2孵箱內培養 72 h后,計數遷移的細胞數,研究 ENCSCs 的遷移能力.

1. 5 統計學分析

數據以x ± s 表示,采用 SPSS 11. 0 統計軟件進行 t 檢驗.

2 結果

2. 1 原代培養 ENCSCs 形態學觀察及鑒定2. 1. 1 原代培養 ENCSCs 形態學觀察 原代培養 1 d 時,可見大小、形態不一的貼壁細胞及細胞碎片\\(圖 1A\\).原代培養2 d 時,瓶底可見部分細胞互相聚集,形成類球狀的細胞團塊,并且有長的突起向周圍延伸\\(圖1B\\).原代培養3 d 時,細胞球樣物體積逐步增大,而且遮光性增加,細胞球之間形成交互的聯接\\(圖 1C\\).第 4 ~ 5 天,貼壁細胞開始離開瓶底懸浮生長,形成神經球樣體\\(圖 1D\\).第 7 ~8 天,神經球形成,體積變大,懸浮生長\\(圖 1E\\).繼續培養可見神經球發出突起"錨"定在培養瓶底部,出現神經網絡,與周圍細胞形成交互的網絡聯接\\(圖 1F\\).

2. 1. 2 原代培養 ENCSCs 干性及多向分化能力鑒定 取傳代培養后8 d 形成的神經球進行 P75 和 Nestin 免疫熒光雙標染色.結果顯示神經球整個球體均充滿 P75 和 Nestin 的熒光共表達,提示所獲得的神經球內含大量 ENCSCs.另取傳代培養后 8 d 形成的神經球加入分化培養基中,分化培養 3 d,見神經球貼壁生長,神經球逐漸消失,大量細胞從神經球內遷出,免疫熒光對細胞進行染色\\(圖 2\\),顯示 ENCSCs 可以分化為神經元\\(TUJ1+\\)、神經膠質細胞\\(GFAP+\\)、平滑肌細胞\\(α-SMA+\\),提示原代培養的 ENCSCs 具有多向分化能力.

2. 2 BMP2 對原代培養 ENCSCs 生物學行為的影響2. 2. 1 BMP2 對 ENCSCs 成球率的影響 在 低濃度下,ENCSCs成球能力對 BMP2 具有濃度依賴性.隨濃度增加\\(10 ~80 ng / mL\\),ENCSCs 成球能力逐步增強,但在高濃度 \\( 80 ~120 ng / mL\\) 下,BMP2 不能無限促進 ENCSCs 成球能力\\( 圖 3\\),表明 BMP2 對 ENCSCs 成球率影響在低濃度時具有濃度依賴性,高濃度時無明顯差異.

2. 2. 2 BMP2 及 GDNF 對 ENCSCs 增殖能力的影響 正常培養情況下,ENCSCs 增殖緩慢,BMP2 或 GDNF 單獨應用均能促進 ENCSCs 的增殖能力\\(P < 0. 05\\),兩者聯合應用時,對ENCSCs 的增殖能力有協調增強作用\\( P < 0. 05,圖 4\\) .這提示BMP2 及 GDNF 均對 ENCSCs 的增殖具有正向調節能力,且兩者有協同促進作用.

2. 2. 3 BMP2 及 GDNF 對 ENCSCs 遷移能力的影響 利用ENCSCs 向外遷移的特點,采用腸片三維立體培養法研究 BMP2在 ENCSCs 遷移中的作用,結果顯示,與對照組[\\(31 ±5\\)個/高倍視野]相比,BMP2[\\(64 ±8\\)個/高倍視野]或 GDNF[\\(114 ±14\\)個/高倍視野]單獨培養均能促進 ENCSCs 向外遷移\\(P <0. 05\\) ,兩者共同作用時[\\(187 ± 21\\) 個 / 高倍視野]ENCSCs 遷移能力顯著增加\\(P <0. 05,圖 5\\).這提示 BMP2 對 ENCSCs 的遷移具有正向調節能力,且與 GDNF 有協同促進作用.

3 討論

腸神經系統起源于 VC,在胚胎發育過程中,VC 的干細胞遷移到達腸道頭端,沿頭端向尾端移行,并定植分化為腸神經系統.遷移至腸道內的神經嵴干細胞稱為 ENCSCs[1].為便于研究 ENCSCs 形成腸神經系統的生物學機制,國外一些實驗室從胎鼠或成年鼠體內提取 ENCSCs 獲得成功[6],國內亦有研究者從大鼠或小鼠腸道提取 ENCSCs[7].盡管如此,由于 ENCSCs 存在于腸壁肌間,除神經源性細胞外,還有大量的間充質細胞、表皮細胞等,因此 ENCSCs 獲取比較困難,技術要求相對較高.

ENCSCs 具有所有干細胞的共性,如自我更新和多向分化能力.目前對干細胞鑒定主要是通過其生物學行為及相應標記物進行.本研究從大鼠胎腸獲得的ENCSCs 經體外培養后形成神經球,并可多次傳代培養,表明提取的細胞具有自我更新和增殖能力.

ENCSCs 可表達低親和力神經營養因子受體 P75NTR而不能分化出少突膠質細胞,中樞神經系統干細胞恰好與之相反[8],因此可以作為 ENCSCs 的特異性標記物.

Nestin 是一種中間絲狀蛋白---神經巢蛋白,是早期胚胎神經上皮干細胞和神經干細胞的特異性標記物.Holmin 等[9]采用免疫組織化學法證實,幾乎所有的神經干細胞存在 Nestin 陽性表達.目前,大多數研究都是采用 Nestin 作為神經干細胞的標記物,隨著神經干細胞不斷分化成熟,Nestin 的表達量逐漸降低直至消失[6].本研究采用 P75 和 Nestin 免疫熒光雙標記的方法,對獲得的神經球進行干細胞鑒定獲得成功.

ENCSCs 具多向分化能力,一定條件下可以分化為神經元、神經膠質細胞和平滑肌細胞.本研究對獲取的神經球在含血清的培養基中分化培養 3 d 后,可見神經球貼壁,大量細胞從球體內遷出,采用免疫熒光技術對分化細胞進行多向分化潛能的鑒定.本研究發現所獲得的干細胞可以分化為神經元\\(TUJ1+\\)、神經膠質細胞\\(GFAP+\\)和平滑肌\\(α-SMA+\\),證實所獲得的 ENCSCs 具多向分化潛能.綜上所述,我們采用機械分離和酶消化法從胎腸獲取 ENCSCs,經反復傳代提高其純度,所得到的細胞表達干細胞特異性標記物,并具有自我更新和多向分化潛能,證實獲取成功,旨在為進一步研究相關細胞因子在 ENCSCs 調控中的作用奠定基礎.

在外周神經系統發育過程中,BMPs 對不同時期的 ENCSCs 有不同的作用.在胚胎發育早期,BMPs 直接參與了神經管背側 ENCSCs 的形成,在 ENCSCs 的遷移過程中,促進干細胞向外周神經元分化[10].

BMPs 還可以調節體外培養的原代外周神經元及細胞系對營養因子的反應性[11 - 12].以上研究提示 BMPs 在促進 ENCSCs 的形成、遷移及分化方面具有多重作用.

腸神經系統發育方面,目前研究表明 BMPs 信號主要在腸神經系統前體發育過程中起重要作用[13].

BMP2 和 BMP4 屬于同一種亞型,可以與相同的受體結合,在胚胎發育早期,BMP2 和 BMP4 協同促使ENCSCs 的發生.Goldstein 等[14]在雞胚體內研究了BMPs 的具體定位,發現 BMPs 在鳥類消化道及內臟平滑肌神經系統均有表達,且具有時相性,如果阻斷BMPs 表達,腸神經元數目減少且異位表達,表明BMPs 在鳥類腸神經系統的形成、發展、分化過程中均起到重要作用.在大鼠體內,BMP2 在胚胎 12 ~ 14 d時達 高 峰,且 BMP2 表 達 受 到 其 受 體 BMPR1A、BMPR1B、BMPR2 以及其拮抗劑 noggin 的影響[15].此外,BMP2 可以促進體外培養的 ENCSCs 克隆形成及向腸神經元分化[16].以上研究表明,BMPs 廣泛參與了腸神經系統的各個過程,目前對其確切的作用機制,對 ENCSCs 遷移、增殖、分化等方面的作用尚無明確的論斷.

本研究發現,不同濃度 BMP2 對 ENCSCs 成球率的影響具有正向調控作用,在低濃度時,具有濃度依賴性,說明 BMP2 在 ENCSCs 增殖過程起不可或缺的作用,但其確切作用機制尚需進一步證實.

GDNF 是 RET 編碼蛋白的配體,GDNF 基因突變合并 RET 基因突變時常加重腸無神經節細胞癥的臨床癥狀.研究證實,GDNF 在腸神經系統發育中廣泛參與腸神經元的形成、增殖和分化過程[17],是目前已知的對 ENCSCs 遷移具有正向調控作用的因子.本研究采用腸段三維立體培養技術探索 BMP2 對 ENCSCs的遷移作用,BMP2 單獨應用即可促進 ENCSCs 向外遷移,在與 GDNF 合用時,促 ENCSCs 遷移的能力增強.

在相同的培養條件下發現 BMP2 和 GDNF 均能顯著增強 ENCSCs 的增殖能力,兩者合用時效果最為明顯.

綜上所述,BMP2 對 ENCSCs 的遷移、增殖均具有重要作用,GDNF 可以增強其正向調節作用,說明BMP2 對腸神經系統的發育具有重要作用,為我們更深入地了解腸神經系統的發育以及先天性巨結腸發生機制奠定了實驗室基礎.

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