目前，國內外研究多集中于干細胞向神經細胞分化的研究，而對體細胞的研究相對較少。干細胞存在倫理學、免疫排斥以及潛在的致瘤性等問題限制了其在臨床上的應用，而具有部分胚胎干細胞特性的人羊膜上皮細胞\\(human amniotic epithelial cells，HAEC\\)不存在上述問題，從而為細胞治療提供了新的選擇。
HAEC是一種來源于人胎盤羊膜組織的上皮層體細胞。研究顯示HAEC具有部分胚胎干細胞特性，即在體外培養下具有向3個胚層分化的潛能：內胚層\\(胰腺細胞、肝細胞\\)、中胚層\\(心肌細胞\\)和外胚層\\(神經細胞、肌細胞、心肌細胞，骨細胞，脂肪細胞，胰腺細胞，肝細胞\\)。細胞生活的微環境在分子水平決定了細胞的分化方向，因此在維甲酸誘導體外培養的HAEC向神經樣細胞分化的過程中，選擇最佳維甲酸干預濃度是決定成功與否的關鍵。本實驗通過細胞形態學分析和檢測細胞內巢蛋白\\(nestin\\)、微管相關蛋白2\\(MAP-2\\)、膠質纖維酸性蛋白\\(GFAP\\)和轉錄因子Oct-4表達，探討維甲酸誘導HAEC在體外分化為神經樣細胞的最適濃度，為HAEC在細胞移植中的應用奠定基礎。
材料與方法
材料與試劑 羊膜標本由復旦大學附屬中山醫院婦產科提供，本研究經產婦本人簽署知情同意書，并經中山醫院倫理委員會同意。DMEM/F12、特級胎牛血清、PBS緩沖液、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰蛋白酶+0.02EDTA \\(GibcoLtd，美國\\)。Ⅱ型膠原酶、Dnase 酶\\(Sigma Ltd，美國\\)。鼠抗人vimentin 單克隆抗體\\(SR0746，EpitomicsInc，美國\\)。鼠抗人CK-19抗體\\(BM0033\\)、兔抗人Nestin多抗\\(BA1289\\)、鼠抗人MAP-2多抗\\(BM1243\\)、兔抗人GFAP多抗\\(BA0056\\)\\(武漢博士德生物工程有限公司，中國\\)。兔抗人Oct-4多抗\\(MAB4305\\) \\(Millipore Ltd，美國\\)。100、200、300、400篩網\\(上海瑞谷生物科技有限公司，中國\\)。
羊膜組織提取和處理HIV、梅毒、乙肝等血清學反應陰性的足月剖宮產后胎盤，胎盤娩出后，無菌條件下2~4 h將羊膜與絨毛膜分離，并將羊膜置于DMEM/F12 培養液內保存。羊膜上皮細胞的原代培養應在羊膜取得后6 h內進行。
原代HAECs 培養將5 cm×5 cm大小的羊膜置于含有雙抗\\(100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素\\)的PBS 中反復沖洗 3次。然后放入不加血清的DMEM/F12培養基中漂洗3次。將漂冼后的羊膜用眼科剪剪成數小塊；再將組織塊反復剪成1 mm×1 mm大小。取10 mL羊膜組織懸液，按1∶4比例加入0.25%的Ⅱ型膠原酶，并置于37℃恒溫振蕩孵箱內消化2 h后，1 000 r·min-1離心5 min，吸出上清液\\(含膠原酶消化液\\)。再加入等體積0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA室溫下消化15 min，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化。1 000r·min-1離心5 min，去上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基清洗后，將細胞懸液依次通過100、200、300、400 目篩網過濾，細胞計數，然后將細胞以 1 × 107個/mL 密度的 HAECs 懸液 2 mL 接種于 25 mL 培養瓶中，置5%CO2、37℃培養箱內培養。倒置顯微鏡動態觀察細胞形態變化及生長增殖情況。3 d后首次換液，以后根據細胞生長情況，隔天換液，每次換液時去除非貼壁細胞。待3~4 d 后細胞融合長滿時，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1∶2 或1∶3 比例進行傳代，倒置顯微鏡觀察，待細胞鋪滿瓶底時，重復上述操作。
原代HAECs的鑒定取第3代HAECs制作細胞爬片。常溫下將細胞爬片用PBS漂洗3 min，×3次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3 min，×3次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入正常的山羊血清室溫下封閉30 min，PBS漂洗3 min，×3次；加入鼠抗人CK19\\(1∶100\\)抗體和鼠抗人vimentin\\(1∶100\\)抗體，37℃孵育2 h，PBS漂洗3 min，×3次；加入辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育30min，PBS洗3min，×3次；DAB暗環境下顯色；自來水沖洗，蘇木精復染2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察并攝像。對照組用PBS代替一抗。
不同濃度維甲酸誘導HAECs向神經樣細胞分化 消化收集第3 代HAECs 制成細胞爬片，待細胞生長至60%~70% 融合時\\(對照組用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養基培養\\)，各維甲酸組去除培養基，加入含不同濃度維甲酸的DMEM/F12誘導液\\(內含10%胎牛血清\\)。
實驗分組 共分為5組：①對照組，含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基處理，不含維甲酸；②1×10-8mol·L-1維甲酸組[含1×10-8mol·L-1維甲酸DMEM/F12培養基\\(含10％胎牛血清\\)]；③1×10-7mol·L-1維甲酸組[含1 × 10-7mol·L-1維甲酸DMEM/F12培養基\\(含10%胎牛血清\\)]；④1×10-6mol·L-1維甲酸組[含1×10-6mol·L-1維甲酸的DMEM/F12培養基\\(含10% 胎牛血清\\)]；⑤1 ×10-5mol·L-1維甲酸組[含1×10-5mol·L-1維甲酸的DMEM/F12 培養基\\(含 10% 胎牛血清\\)]。每天換液，換液時去除非貼壁細胞，共誘導7 d。
不同濃度維甲酸誘導HAECs分化后Nestin免疫組化染色
取出細胞爬片。常溫下，將細胞爬片PBS漂洗3 min，×3次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3 min，× 3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 漂洗3 min，×3 次；加入正常的山羊血清，室溫下封閉30 min，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入兔抗人 Nestin 抗體\\(1∶100\\)，37℃孵育2 h，PBS 漂洗3 min，×3 次；加入辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3 min，×3次；DAB暗環境下顯色；自來水沖洗，蘇木精復染2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察細胞并攝像，Nestin標記的神經樣陽性細胞呈棕褐色。
不同濃度維甲酸誘導HAECs分化后MAP-2免疫組化染色
取出細胞爬片。常溫下，將細胞爬片PBS漂洗3 min，×3次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3 min，× 3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS漂洗3 min，×3次；加入正常的山羊血清室溫下封閉30 min，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入兔抗人 MAP-2抗體\\(1∶100\\)，37℃孵育2 h，PBS漂洗3 min，×3次；加入辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3 min，×3次；DAB暗環境下顯色；自來水沖洗，蘇木精復染2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察細胞并攝像，MAP-2標記的神經樣陽性細胞呈棕褐色。
不同濃度維甲酸誘導HAECs分化后GFAP免疫組化染色
取出細胞爬片。常溫下，將細胞爬片PBS漂洗3 min，× 3 次；4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 漂洗 3min，× 3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 漂洗3 min，×3次；加入正常的山羊血清室溫下封閉30 min，PBS漂洗3 min，×3次；加入兔抗人GFAP抗體\\(1∶100\\)，37℃孵育 2 h，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3 min，×3 次；DAB 暗環境下顯色；自來水沖洗，蘇木精復染 2min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察細胞并攝像，GFAP標記的神經樣陽性細胞呈棕褐色。
不同濃度維甲酸誘導HAECs分化過程中Oct-4免疫組化染色取出細胞爬片。常溫下將細胞爬片PBS洗3min，×3次；4% 多聚甲醛固定10 min，PBS洗 3 min，×3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 洗 3 min，×3 次；加入正常的山羊血清室溫下封閉 30 min，PBS 洗3 min，× 3 次；加入兔抗人 Oct-4 抗體\\(1∶100\\)，37℃孵育2h，PBS洗3 min，×3 次；加入辣根過氧化酶標記的二抗，37℃孵育30 min，PBS 洗3 min，×3次；DAB暗環境下顯色；自來水沖洗，蘇木精復染2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察細胞并攝像，Oct-4標記的神經樣陽性細胞呈棕褐色。
圖像分析 隨機取10 個不同視野\\(×100\\)，以每個視野內陽性細胞數為量化指標，每組視野陽性細胞數量作為該組HAECs 誘導分化為神經樣陽性細胞密度代表值，以陽性細胞數/100倍視野表示。
統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件進行統計學分析。各組計量資料以 ±s表示。各組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有顯著統計學意義。
結 果
體外培養 HAECs 細胞的生長特性 倒置顯微鏡下觀察細胞在貼壁前輪廓清晰、體積較小、圓形、透亮、折光性較強、富有立體感。接種2~3 d后貼壁，細胞逐漸變大，折光性降低，整個細胞輪廓變暗，完全伸展的細胞形態多樣，呈梭形、多角形、眼睛樣等，輪廓清晰，胞質豐富，胞核居中，可見1~2個核仁，呈圓形、卵圓形。
接種3 d后，人羊膜上皮細胞進入指數生長期，細胞數量明顯增多，呈不規則多角形。接種5~7 d時90%細胞融合成片，形成單層放射狀或漩渦狀生長，開始進行傳代。傳代6 h 后即可貼壁，細胞3~4 d融合長滿，形成單層放射狀或漩渦狀單層細胞。傳至2~5代，細胞形態、大小、活性均勻一致。傳至6代以后少數細胞形態發生變化，呈不規則形，細胞增殖減慢。傳至第8代細胞胞質內出現空泡和黑色顆粒，細胞增殖能力減弱，逐漸停滯生長，凋亡并從瓶壁脫落。第3代細胞融合后數量恒定，符合實驗要求，取第3代細胞作為實驗對象。
體外培養細胞的來源鑒定 上皮細胞標記物CK19標記的貼壁細胞胞質內有大量棕褐色物質，胞核呈藍紫色\\(圖 1A\\)；間質細胞標記物波形蛋白\\(vimentin\\)標記的貼壁細胞胞質內僅有少量棕褐色物質，胞核呈藍紫色\\(圖1C\\)。
不同濃度維甲酸對HAECs分化作用的影響
1.不同濃度維甲酸組HAECs分化的形態學變化：對照組細胞形態未發生改變；1×10-8mol·L-1維甲酸組少數細胞形態有所改變，胞質回縮，胞體伸出軸突樣長突起；1 × 10-7mol·L-1維甲酸組部分細胞形態發生改變，出現雙極或多級細胞，少數細胞在突出末端出現分支；1×10-6mol·L-1維甲酸組出現較多雙極或多級細胞，部分細胞出現突起并相互連接成網；1×10-5mol·L-1維甲酸組細胞胞質出現空泡或黑色顆粒狀物，大量細胞固縮脫落。
2. 免疫組化法檢測不同濃度維甲酸組HAECs誘導分化細胞的Nestin 陽性細胞\\(圖2，3\\)表達率：對照組為\\(12.12±0.37\\)%，1×10-8mol·L-1維甲酸組為\\(15.13±0.28\\)%，1 × 10-7mol·L-1維甲酸組為\\(17.56±1.15\\)%，1 ×10-6mol·L-1維甲酸組為\\(20.98±0.95\\)%，1×10-5mol·L-1維甲酸組為\\(19.20±3.12\\)%。不同濃度維甲酸組與對照組比較，均差異有顯著統計學意義\\(P<0.01\\)；不同濃度維甲酸組組間比較，除1×10-6mol·L-1維甲酸組、1×10-5mol·L-1維甲酸組外\\(P=0.15\\)，其他組均差異有顯著統計學意義\\(P<0.01\\)。
3. 免疫組化法檢測不同濃度維甲酸組HAECs誘導分化細胞的MAP-2 表達率\\(圖2，3\\)：對照組為\\(14.12 ±1.04\\)%，1× 10-8mol·L-1維甲酸組為\\(22.81±1.32\\)%，1×10-7mol·L-1維甲酸組為\\(24.21±1.65\\)%，1×10-6mol·L-1維甲酸組為\\(29.56 ±1.35\\)%，1×10-5mol·L-1維甲酸組為\\(24.34±3.85\\)%。不同濃度維甲酸組與對照組比較，均差異有顯著統計學意義\\(P<0.01\\)；不同濃度維甲酸組組間比較，除1×10-6mol·L-1維甲酸組、1×10-5mol·L-1維甲酸組外\\(P=0.23\\)，其他組均差異有顯著統計學意義\\(P<0.01\\)。
4. 免疫組化法檢測不同濃度維甲酸組HAECs誘導分化細胞的 GFAP 表達率\\(圖2，3\\)：對照組為\\(11.23 ±0.26\\)%，1 × 10-8mol·L-1維甲酸組為\\(13.21±0.60\\)%，1×10-7mol·L-1維甲酸組為\\(15.63±1.18\\)%，1×10-6mol·L-1維甲酸組為\\(22.69±1.62\\)%，1×10-5mol·L-1維甲酸組為\\(15.79 ±3.31\\)%。不同濃度維甲酸組與對照組比較，均差異有顯著統計學意義\\(P<0.01\\)；不同濃度維甲酸組組間比較，除1×10-6mol·L-1維甲酸組、1×10-5mol·L-1維甲酸組外\\(P=0.27\\)，其他組均差異有顯著統計學意義\\(P<0.01\\)。
5. 免疫組化法檢測不同濃度維甲酸組HAECs誘導分化細胞的 Oct-4 表達率\\(圖 2，3\\)：對照組為\\(25.23 ±3.12\\)%，1× 10-8mol·L-1維甲酸組為\\(18.12±1.23\\)%，1×10-7mol·L-1維甲酸組為\\(12.65±0.52\\)%，1×10-6mol·L-1維甲酸組為\\(10.02±0.28\\)%，1×10-5mol·L-1維甲酸組為\\(9.65±2.03\\)%。不同濃度維甲酸組與對照組比較，均差異有顯著統計學意義\\(P<0.01\\)；不同濃度維甲酸組組間比較，除1×10-6mol·L-1維甲酸組、1×10-5mol·L-1維甲酸組外\\(P=0.19\\)，其他組均差異有顯著統計學意義\\(P<0.01\\)。
討 論
HAECs為人體正常細胞，其能夠在體外大量培養且被誘導分化為不同類型的細胞[5]，且HAECs還具有低免疫原性、不具致瘤性及無倫理法律問題等優點[4]，為治療神經系統退行性疾病和外傷性神經損傷帶來新的契機。但目前維甲酸誘導HAECs 分化的研究仍不十分完善，本研究擬探索不同濃度維甲酸對HAECs的誘導分化作用，從而確定其最適濃度，為HAECs在臨床治療神經系統疾病提供理論基礎。
Takashima 等研究發現：新鮮分離的HAECs能夠表達α抗胰蛋白酶、CPS-I、CYP2D6、CYP3A4等肝細胞功能基因及 HNF-3γ、HNF-4、C/EBP-α、HNF-1等轉錄因子，在加入1×10-7mol·L-1地塞米松和0.1 ?mol·L-1胰島素誘導1周后，上述功能基因隨誘導天數增加表達也逐漸增強。此外，還發現誘導后的HAECs能夠合成并分泌白蛋白、儲備糖原的功能，這正是肝細胞所具有的典型功能。
Miki等研究發現：HAECs加入10 mmol·L-1尼克酰胺懸浮培養14 d后，可檢測到胰島發育、胰島功能基因，如胰腺十二指腸同源盒\\(PDX1\\)、神經源素3\\(Ngn3\\)、同源異形盒轉錄因子6\\(PDX6\\)、胰島素、胰高血糖素的表達，且隨著培養基中葡萄糖濃度的升高，胰島素分泌也增加，證實HAECs可向胰腺樣細胞分化。
Miki 等還發現：HAECs在加入1 mmol·L-1抗壞血酸磷酸鹽培養14 d 后，可以檢測到心肌特異性基因表達，如轉錄因子Nkx2.5和GATA-4及房、室肌球蛋白輕鏈2\\(MLC-2A，MLC-2V\\)。此外免疫組織化學染色檢測到α-輔肌動蛋白和特異性結蛋白等肌系細胞標志物，證實HAECs體外誘導下也可表現出心肌細胞的特性。
多項研究發現[13~16]，HAECs表達神經元特異性標記物MAP-2、神經膠質標記物GFAP和神經干細胞標志物Nestin，在堿性成纖維生長因子、神經生長因子、表皮生長因子等多種生長因子和\\(或\\)維甲酸誘導下，能夠上調Nestin、MAP-2和GFAP表達，具合成釋放乙酰膽堿、兒茶酚胺、多巴胺及去甲腎上腺素等多種神經遞質的功能，且能合成釋放神經營養因子3、神經生長因子、腦源性神經營養因子等多種因子，證實人羊膜上皮細胞可向神經樣細胞分化。
本研究采用免疫組化技術證實HAECs在維甲酸誘導下可導致Nestin、MAP-2、GFAP陽性細胞增多，Oct-4陽性細胞表達減少，促使HAECs 向神經樣細胞分化；并將HAECs暴露于不同的維甲酸濃度下，根據神經樣細胞的陽性比例尋求出維甲酸體外誘導HAECs向神經樣細胞分化的最適濃度，結果表明維甲酸最適濃度為1 ×10-6mol·L-1。值得注意的是，在HAECs原代培養中，加入了1×10-5mol·L-1維甲酸誘導后細胞胞質內出現空泡樣改變，大量細胞固縮脫落，并可見部分細胞碎片，提示維甲酸具有一定毒性，過高濃度的維甲酸可導致HAECs凋亡。
體外培養HAECs內上皮細胞特異性標記物CK19表達強陽性，證實培養細胞為上皮細胞，但部分細胞仍低表達vimentin，表明經過體外培養可能引起HAECs的去分化，也可能是羊膜組織上發生了上皮-間質轉分化?？傊?，本研究顯示HAECs可在維甲酸誘導下轉化為神經樣細胞，1×10-6mol·L-1維甲酸為最適誘導濃度，證實HAECs具有分化為神經細胞的潛能。本研究為臨床上應用細胞治療神經系統疾病提供新思路。
