胚軸（ embryonic axes） 形成是多細胞生物軀體模式（ body plan） 建立的一個重要過程，主要包括前- 后軸 （ anterior-posterior axis ） 、背 - 腹軸 （ dorsal-ventral axis） 和左 - 右軸（ left-right axis） .對兩棲動物胚胎的研究發現背 - 腹軸早在受精后即可觀察到，如爪蛙胚胎皮層轉動形成的灰色新月區在后期發育成背部。德國發育生物學家 Hans Spemann 和他的學生 Hilde Mangold 將原腸早期蠑螈胚胎的背部組織移植到另一種蠑螈胚胎的腹部，得到了形成雙體軸的胚胎，次級體軸的脊索來自于供體胚胎，而神經管和體節多數來自于受體，這說明該背部組織能誘導周圍受體胚胎的細胞形成神經管，首次提出了胚胎誘導的概念并稱該背部組織為組織者（ or-ganizer） .

ripply 家族蛋白在 2005 年被發現并揭示了其部分功能[1],研究發現 ripply1 和 ripply2 特異表達于體節，其中 Ripply1 蛋白與轉錄輔抑制因子 Groucho 結合，能夠終止分節基因的表達，維持體節的前后極性。之后對 ripply1 的研究都集中在其在體節時期對體節發生的作用，而其在早期胚胎模式發生的作用卻研究甚少。但最近在爪蛙中的研究發現 ripply家族蛋白能通過其 WRPW 區域結合多梳蛋白（ Polycomb group proteins） 起轉錄去抑制的作用，并且在背 - 腹軸形成過程中起重要作用[2].然而，rip-ply 家族基因在胚胎發育早期的表達圖式和調節方式還不清楚。并且，ripply3 是人的唐氏綜合征關鍵區域基因 6（ Down syndrome critical region gene 6,dscr6） 的同源基因[3].因此，研究 ripply 家族基因的功能和作用機制能為人類遺傳疾病的致病機理提供信息。我們通過原位雜交技術發現 ripply1 在斑馬魚早期胚胎中特異表達在背部，因此推測其可能參與背腹發生。故而通過過 表 達 ripply1,并 調 取1. 2 kb的啟動子片段，初步研究其在胚胎早期背腹發生的作用。

1 材料和方法

1. 1 材料

AB 品系的斑馬魚養殖在 28. 5℃ 的循環水系統中，如早期工作所描述[4].

1. 2 方法

1. 2. 1 獲取 ripply1 cDNA取斑馬魚胚盾（ shield） 時期的胚胎 50 枚，用 Tr-izol 方法提取胚胎總 RNA,使用 Transgene 公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒反轉錄，詳細步驟參見使用說明書。

1. 2. 2 斑馬魚 ripply1 整胚原位雜交調取 ripply1 全長 cDNA,引物序列如下 ripply1-F: 5 '-CAGCGCCAAACAAAACG-3 ',ripply1-R: 5 '-TCAAATTCGCACAGACGG-3',使用 Taq 酶擴增后將其連入 pGEM-T 載體中。根據測序方向合成地高辛標記的反義 RNA 作為探針使用。其他探針如goosecoid （ gsc） 、chordin （ chd） 、floating head （ flh） 、even-skipped-like 1 （ eve1） 、T-box6 （ tbx6） 、wnt8a 詳見作者以前的工作[5].合成的 ripply1 反義 RNA 用原位雜交液 hyb+（ 50%甲酰胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20,0. 5 mg/mL酵母 RNA,0. 05 mg/mL 肝素） 稀釋至 1 ng/μL.收集不同時期的斑馬魚胚胎，固定于 4% 多聚甲醛中過夜。過渡到含 0. 1% Tween-20 的 PBST 中，并在PBST 中將胚胎膜剝去，用 PBST 洗過后在原位雜交液 hyb-（ 50% 甲酰胺，5 × SSC,0. 1% Tween-20） 中65℃ 孵育 10 min,之后在 hyb+中 65℃孵育 4 h.探針 60℃ 孵育過夜。第 2 天吸出探針以重復使用。