隨著現代科學技術和工業生產的迅速發展以及生活水平的提高，人類所面臨的各種有害化學物質與新合成的化學物質、居室內外的空氣污染物及一些生物、物理因素等對人體有害的因子越來越多。因此檢測相關因子對生物個體潛在的遺傳毒性及胚胎發育毒性的技術和方法也日益豐富。由于醫學實驗動物的胚胎發育時期比成年動物對環境中有害因素的影響更敏感，故常以檢測胚胎發育毒性作為評價和篩檢外源性化學、生物等因素的主要方法之一，同時也可探討其致畸作用機理、染毒劑量、時間及胚齡與致畸效應之間的量效關系和時效關系等，為各類物質的發育毒性提供安全性評價依據。
動物胚胎的器官形成期是由胚胎細胞快速分裂、增殖、分化、運動、聚合并形成組織器官原形的過程，如果進行體外器官培養則能避免母體內多種因素的干擾，且能保持其體內所具有的細胞間相互作用及形態特征和功能，它所經歷的器官發生階段與體內表現有一致性，所以生殖毒理及胚胎發育毒理的研究大多采用大鼠與小鼠鼠胚、雞胚、兔胚、斑馬魚胚等多種實驗動物胚胎材料進行體外全胚胎培養技術、或體外胚胎器官培養技術（如胚胎肢芽、上頜發育等）以及胚胎原代細胞培養技術（如肢芽細胞、中腦細胞、海馬細胞、心肌細胞、成纖維細胞）等，但是目前最常用仍為大鼠與小鼠的胚胎肢芽培養模型[1],因為此試驗方法中所選擇的胚胎肢芽細胞正處于分化前期，所以只要對動物胚胎增殖分化有毒性作用的外來化合物，都有可能抑制胚胎肢芽的形成及軟骨的發生。因此，肢芽器官及肢芽細胞培養技術，既可以作為化學致畸物的安全評價系統，又可應用于胚胎發育毒性機理的研究。本文就近 15 年來我國肢芽器官與肢芽細胞體外培養技術的應用及進展作一綜述。
1 動物胚胎肢芽體外培養常用的技術
目前動物肢芽體外培養實驗方法大多選擇以小鼠、大鼠胚胎的肢芽為體外培養材料，常采用兩種的技術方法 :
第一，以肢芽整體器官在體外培養為主的試驗方法，稱肢芽器官培養法。是指應用顯微解剖技術從動物體內分離出整體肢芽器官，在體外實驗室里盡可能模擬體內的生存條件進行培養，使其生存、繼續生長、正常發育，并保持其有正常的結構與功能，以便在可控條件下進行形態學、組織學等多方面的實驗研究。如對培養后的大鼠或小鼠肢芽進行阿利新藍染色，可觀察其軟骨的發育并對其發育狀態給予評價（如 Neubert 評分）[2],或肢芽整體包埋切片后觀察肢芽軟骨發育的形態學變化，或應用免疫組化、原位雜交等方法檢測各種與發育相關基因、蛋白的表達，以分析其影響發育的機制。此方法的特點是能體現肢芽的整體發育狀況，并可與體內相當發育時期的肢芽作對比分析，以探討體外培養時檢測某單一因素對胚胎的發育毒性。第二，以胚胎肢芽制備原代肢芽細胞懸液在體外培養為主方法，稱肢芽細胞培養法。此方法可使肢芽中未分化的間充質細胞經體外培養后，對細胞增殖的影響進行檢測，或者肢芽細胞經培養后能夠相互的識別、移動、粘附著后聚集在一起，對形成分化后的軟骨細胞集落進行觀察。此項技術最早由 Flint 等在 80 年代建立的，后來 Renault 等又加以改進成微團培養法，一般采用正在分化的嚙齒類及鳥類的胚胎原代肢芽細胞體外培養模型，模擬體內發育過程，研究細胞間通訊、細胞和胞外基質的相互作用，用于分析各種暴露因子的生殖與發育毒性[3,4],在我國開展此項技術始自上世紀 80 年代初期，至 90 年代中期開始廣泛用于發育毒性物質的檢測中。并發現一些化學致畸物大多也都是細胞分化抑制劑，能使微團培養物中的細胞集落形成數明顯減少，通過細胞集落數的變化研究化學物對肢芽軟骨發生的作用，判斷其發育毒性。
2 肢芽培養技術在發育毒理學中的研究與應用
2.1 有毒化學物質及環境污染物對肢芽細胞增殖分化的影響
近年來人們針對室內的環境污染日益擔憂，如甲醛、二甲苯、氟等多種有毒物質的污染對于人類發育中的嬰兒、幼兒及胚胎均有著不同程度的遺傳毒性及胚胎發育毒性。
有學者選用小鼠肢芽體外培養方法分別研究了甲醛、苯、氟化物及乙醛的發育毒性，結果發現均可抑制小鼠胚胎肢芽的發育和分化，證實是潛在的致畸物。如吳成秋、李梓民等發現隨著培養液中苯的染毒濃度的增加，培養的小鼠胚胎肢芽軟骨細胞的集落數會逐漸減少，肢芽細胞增殖受到抑制，兩者均呈現較強的劑量 - 效應關系[5-8].張全新、屈衛東等則均選用了大鼠胚胎肢芽細胞體外培養，也證實甲醛、甲苯、二甲苯這三種污染室內生活空氣的主要物質具有上述研究的類似作用，且聯合染毒后毒性有相加作用[9];屈衛東也證實了乙醛具有發育毒性作用和潛在的致畸作用[10].
丙烯睛（ACN）、雙酚 A（BPA）、等均為重要的有機化工原料，且有著不同程度的毒性，在其工業生產、加工運輸、儲藏銷售等多種環節均與人類有著密切的接觸。對這些化學有機物質的各類毒性研究范圍也在不斷拓展。如端禮榮等用大鼠胚胎肢芽細胞培養技術研究發現丙烯睛能抑制胚胎肢芽細胞增殖和分化，并經其它檢測指標分析，丙烯晴抑制了肢芽細胞蛋白質合成、引起脂質過氧化而產生了細胞毒性[11].曾懷才等用小鼠胚胎肢芽細胞通過彗星實驗檢測了環境污染物氯化三丁基錫（TBTCI）證實其具有遺傳毒性[12].李勇、龍鼎新等采用大鼠肢芽細胞微團培養技術檢測了工業污染物雙酚 A、對 - 壬基酚，證實均具有抑制肢芽細胞增殖作用，屬于陽性致畸物[13,14].
2.2 微量元素對肢芽細胞增殖分化的影響
通過肢芽培養技術可以檢測微量元素對肢芽細胞增殖與分化的影響。如硒、鋅等微量元素均是機體必需的，但研究證實機體內微量元素含量過多或過少均會影響胚胎發育，并表現出不同程度的胚胎發育毒性。如國內張全新等采用大鼠胚胎肢芽細胞培養技術研究發現 :亞硒酸鈉在較低的適當劑量有明顯的保護作用，包括抑制畸胎發生。過量就會產生明顯的細胞毒性和細胞分化抑制作用，但由于實驗結果為 IP50 小于 ID50,所以分析過量導致的肢芽細胞分化抑制是一種細胞毒性物質，具有胚胎發育毒性，而不是致畸物，為硒的安全使用和揭示硒的發育毒性提供依據[15].李小玲等通過給小鼠胚胎肢芽細胞體外培養液中加入不同劑量的硫酸鋅，的發現微量元素鋅對小鼠胚胎肢芽細胞的分化和增殖表現為促進和抑制雙重作用，缺鋅及過量鋅均可抑制細胞的分化并產生毒性作用[16].郭衛珍也通過小鼠肢芽細胞培養證實當鋅濃度達43.0~86.0μmol/L時，對胚胎肢芽發育具有明顯的促進作用，而鋅缺乏（0.0μmol/L）時或鋅過量（172.0 ~ 215μmol/L）以上時均也可抑制小鼠胚胎肢芽的發育和分化[17].許遜等選則大鼠胚胎肢芽細胞培養，加入不同濃度的醋酸鋅，得出研究結果與上述類似，即對胚胎肢芽細胞增殖和分化的影響具有低濃度促進，高濃度抑制的雙向效應[18].洪梅等通過大鼠胚胎細胞培養實驗證實 :當鈣和鋅濃度達 50.0 ~ 100.0mol/L 時，對體外培養胚胎肢芽細胞有一定的促進生長分化作用，而鈣和鋅濃度達 200.0mol/L 時則對胚胎肢芽細胞的生長發育有明顯的細胞毒性和抑制作用[19].
