細胞內代謝過程除以碳骨架結構改變為主的物質轉化外， 通常還伴隨輔因子介導的能量轉移。 物質轉化和能量轉移高度耦合， 顯著增加了代謝系統的復雜度。 氧化還原輔因子通過在氧化態和還原態之間循環再生傳遞電子， 將物質轉化途徑關聯成復雜的代謝網絡[1]. 據不完全統計， 在微生物中僅吡啶核苷 酸 輔 酶 （nicotinamide adenine dinucleotide（phosphate）， NAD（P））及其還原態參與的生化反應就超過 1000 種[2], 這還不包括它們參與的其他生物學過程。 傳統生物化學研究提供了大量生物學元件[3,4],系統生物學研究建立了各種代謝模型[5,6], 分子生物學發展提供了有效的遺傳操作方法， 使設計和構建新的高效、受控的物質轉化途徑成為可能。 然而， 輔因子在代謝網絡中的節點作用使各種生化反應建立起復雜的相互作用網絡， 極大地影響了外源途徑在底盤細胞代謝環境中的功能。 以氧化還原代謝為例，新途徑可能破壞宿主內源氧化還原平衡， 從而抑制生長， 使新途徑難以產生預期效果[7]. 人工構建的外源途徑對底盤細胞中天然代謝網絡的相互干擾， 特別是氧化還原環境的干擾， 是影響外源合成途徑與底盤細胞適配性的重要因素。 通過調節胞內輔因子水平， 如控制酶的表達水平、優化代謝途徑、改造酶的輔因子偏好性以及敲除競爭代謝途徑等， 可以優化外源途徑與底盤細胞的適配性， 在一定程度上提高代謝調控效率[8~10]. 但輔因子擾動的生物學效應的可控性和可預見性低。 例如， 琥珀酸生產需要維持胞內較高 NADH 水平， 但高 NADH 水平影響菌株對培養條件的適應性[11]. 設計脂肪酸生產菌株時需要使脂肪酸合成途徑與宿主 NADPH 供給能力相匹配， 但由于無法確定擾動 NADPH 水平對代謝造成的全局性影響， 無法預測合適的外源基因表達強度， 需要篩選不同表達強度的啟動子表達外源基因[12]. 輔因子關聯作用導致的復雜性也是限制代謝途徑可移植性的重要因素。 例如， 在大腸桿菌（Escherichia coli）中構 建 的 高 效 丁 醇 合 成 途 徑 , 移 植 到 藍 細 菌（Cyanobacteria）中就難以達到積累丁醇的效果， 因為藍細菌傾向于積累 NADPH 而非 NADH[13,14].

因此， 提高人工代謝途徑在底盤細胞中的適配性、可預見性和可移植性需要降低代謝系統， 特別是輔因子依賴型氧化還原系統的復雜度。

1 正交氧化還原體系

為降低代謝系統復雜度， 可設計獨立于生長代謝的合成途徑及獨立的輔因子循環再生體系。 這種在復雜代謝體系中執行系統子功能， 并且其執行過程獨立于系統其他組件的子系統稱為正交體系。 正交體系的設計構建過程即“正交化”[15]. 正交氧化還原體系是指電子傳遞獨立于系統其他氧化還原輔因子系統的一種氧化還原體系。 目前主要有兩種策略可用于構建正交氧化還原體系： （?。?在空間上分隔輔因子依賴型體系， 即“空間正交氧化還原體系”; （ⅱ） 構建利用人工輔因子代替天然輔因子的體系， 即“生物正交氧化還原體系”[8,15]. 設計構建正交氧化還原體系， 是減少外源途徑對底盤細胞中天然代謝網絡的干擾， 提高外源合成途徑與底盤細胞適配性的重要策略。 以下綜述正交氧化還原體系的設計和應用特點。

2 空間正交氧化還原體系

空間正交氧化還原體系通過將相關的酶及輔因子限定在特定區域， 提高局部底物和輔因子濃度、減少或避免與其他子系統的相互作用[16,17], 目前主要通過構建融合蛋白和設計蛋白錨定支架實現， 并已有多個成功應用的報道。 另外， 最近發現， 細胞內可形成一些特殊的微區室（microcompartment）， 可以有效限制輔因子或代謝中間體擴散， 從而避免胞內輔因子水平干擾微區室內氧化還原代謝[18,19]. 利用微區室也可構建空間正交氧化還原體系[15].

蛋白融合技術通過基因工程手段將多個酶用短肽序列連接形成融合蛋白， 通過調整連接肽特性和酶的連接方向控制酶的空間定位（圖 1A）， 優化級聯催化過程中底物和能量傳遞[20]. 蛋白錨定支架技術通過調整支架上的錨定位點距離、各種錨定位點的數量和連接肽特性 3 種方式調整酶的空間定位和比例（圖 1B）， 可降低代謝網絡對目標途徑的影響， 提高目標途徑底物和輔因子的局部濃度， 減少與環境的相互影響[21].

兩種空間正交氧化還原體系構建策略都受到連接肽特性的影響， 由于連接肽及蛋白結構和功能的多樣性， 需要通過篩選確定合適的連接肽柔性和長度， 優化酶的空間定位[2,22]. 連接肽通常使用柔性序列 GGGGS（G4S）[23~26], 通過調整其拷貝數改變連接肽長度， 但有時利用剛性氨基酸延長連接肽效果更好， 如將惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）細胞色素 P450（P450cam）、假單胞氧還蛋白（putidaredoxin,P d X ） 和假單胞氧還蛋白還原酶 （ p u t i d a r e d o x i nreductase, PdR）分別與硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobussolfataricus）的增殖細胞核抗原（proliferating cellnuclear antigen, PCNA）融合時， 比較兩組連接肽G4S-（P5）n-G4S（n=1~5）和（G4S）n（n=1~6）效果， 以 G4S-（P5）4-G4S 連接時活性最高（（6.5±0.3） μmol/（L min））， 而（G4S）n（n=1~6）最高活性（G4S）5約為 5 μmol/（L min）[22].相比于柔性， 調節連接肽長度效果通常更顯著， 上述實例中最適連接肽長度對應活性比 n=1 時提高兩倍。

長度選擇也是最常見的連接肽優化方式。 在 P450 單加氧酶CinA的C-末端融合黃素氧還蛋白CinC, 催化桉樹醇轉化為 2-羥基-桉樹醇， 發現當連接肽長度為10 個氨基酸時產量最高， 少于 4 個氨基酸時檢測不到催化活性[2].

除了連接肽特性， 空間正交氧化還原體系構建還需要綜合優化多種因素以在提高體系獨立性的同時獲得更好的催化活性。 構建融合蛋白要考慮融合方 向 對 催 化 效 率 的 影 響 . 將 丙 酮 丁 醇 梭 菌（Clostridium acetobutylicum）來源的氫酶（hydrogenase,H2ase）融合鐵氧還蛋白（ferredoxin, FD）促進產氫時，用 2 個氨基酸殘基連接時， FD 連在 H2ase 的 C-末端對產氫過程無促進作用， 而連在 N-末端氫氣產量提高約 3 倍[26]. 這是因為 H2ase 與 FD 作用位點在氫酶N-末端， N-末端融合更利于兩個蛋白相互作用。 這種融合蛋白組合的催化效率也受連接肽長度的影響，以14個氨基酸殘基連接效果最好， 產氫效率提高近5倍， 延長至 46 個氨基酸殘基幾乎沒有促進作用[26].

與蛋白融合技術相比蛋白錨定支架技術可更自如地設計酶的空間分布和計量關系[27,28]. 仍以上述H2ase 與 FD 生物轉化產氫途徑為例： 將真核信號轉導相關的 PDZ（postsynaptic density protein of 95kilodaltons, disc large, zona occludens-1）， SH3（sarcoma homology 3）和 GBD（gelatin binding domain）3 種結構域整合到支架蛋白上， 通過配體肽段將催化生物合成的酶特異性結合到支架蛋白的對應位置，這種設計可以通過調整 H2ase 和 FD 在支架上的結合位置、酶與支架配體間連接肽的長度、結合域數量等調整酶的空間分布與比例[26]. 結合域在支架上間距靠近時產氫效率高； 結合域相對位置相同， FD 與支架蛋配體白的連接肽長度分別為 10, 20, 40 個氨基酸時， 延長肽鏈長度可使氫氣產量提高 3~5 倍； 通過調整支架蛋白上的 PDZ, SH3 和 GBD 結合域比例調整FD:H2ase 比率， 比率越小產氫效率越高[26].

除了蛋白， DNA, RNA 等大分子也可作為蛋白錨定支架[20,29,30], 并且隨著 DNA 合成技術發展及對DNA, RNA 結構預測能力的提高， 基于核酸的支架受到更多重視。 利用 DNA 整合 NAD（P）H: 黃素單核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）氧化還原酶和熒光素酶， 還原力 NADH 經過 NAD（P）H:FMN 氧化還原酶傳遞給 FMN, 然后傳遞給熒光素酶， 與分別連在兩條不同 DNA 鏈上的游離狀態相比， 連在同一 DNA鏈上時活性提高到 2~3 倍[31]. 支架可以是單個分子，也可以是可自組裝的蛋白亞基。 如將前述 P450cam,PdX, PdR 和亞磷酸脫氫酶分別與 PCNA 融合時， 構建融合蛋白 PCNA-PdR, PCNA-P450cam 和 PTDH-PCNA-PdX, 3 個融合蛋白的 PCNA 亞基通過自組裝形成三聚體將 4 個酶進行空間整合， 促進反應中的電子傳遞， 組裝復合體比游離酶催化速率提高 2 倍[22,32].

以上空間正交氧化還原體系的應用表明， 通過減少天然氧化還原體系的干擾， 可以有效提高目標氧化還原體系的效率和可預見性。