1、引言
在生物細胞檢測領域,光學手段正發揮愈來愈重要的作用,其中,基于彈性散射光的光學檢測方法可以在不引入外源介質的情況下,測量分析處于自然狀態下的活細胞的內部結構分布及變化。和光強度角度分布探測方法相比,基于彈性散射光的測量方法具有光學系統簡單,獲取信號精度高等優勢。其檢測原理在于細胞內部的多種亞細胞器不僅呈顆粒狀,而且具有與細胞質不同的折射率,因此能夠使入射光產生彈性散射;通過測量入射激光在不同角度上的強度分布或某個固定角度上的光譜,即可完成細胞形態的檢測。此外,綜合這兩種測量方式進行細胞檢測的實驗系統也已經問世。
目前,根據測量角度范圍的不同,基于彈性散射光譜的顆粒尺寸精密測量可以分為幾種典型方式:一種是在背向很小的一個角度范圍內測量的背向彈性散射光譜測量;一種是在背向較大角度范圍內測量的共聚焦背向彈性散射光譜測量;還有一種是在側向較大角度范圍內測量的暗場彈性散射光譜測量。后2種方式可以實現對單個球形顆粒的成像以及對其尺寸的超衍射極限分辨提取,但兩者均對建立散射角積分計算模型提出了很高的要求。雖然第一種方式只能用于測量包含大數量球形顆粒的懸浮溶液,但卻擁有散射理論模型簡單、分析推斷顆粒尺寸精度高的優點;而且通過尋求更為先進的光譜數據分析方法,該方式能夠更為快速地獲得球形顆?；旌先芤褐械念w粒尺寸分布。
本文集中探討了背向彈性散射光譜測量中獲取光譜的不同實驗方法及其優缺點,通過實驗結果比較了目前普遍使用的光纖探頭測量和透鏡系統平行光入射及收集測量兩種方法。本研究不僅能為實際應用中光譜獲取方法提供參考依據,還可以為光譜獲取方法的優化設計提供借鑒。
2、光譜獲取及分析的基本原理
2.1微米顆粒的背向彈性散射光譜特性
在不考慮光吸收的情況下,微米球形顆粒的背向散射光譜呈現規則的周期起伏。對于折射率與周圍介質相近的顆粒,這種特征可以由Ray-leigh-Gans近似公式來理解:
其中:L為測量距離,k=2π/λ,V為顆粒體積,m為顆粒的相對折射率\\(接近于1\\),I0為入射光強度,θ為散射角,G\\(u\\)=3\\(sin u-ucos u\\)/u3,x=ka定義為尺度參數,a為顆粒半徑。當θ≈180°時,光譜的周期性主要來自于G\\(2x\\)。一般顆粒的周期性需要通過Mie散射數值計算結果進行解讀。這種特征性周期光譜結構使得利用彈性散射光譜獲得超衍射極限分辨的顆粒尺度信息成為可能。
然而,在實際的光譜獲取及分析中,θ實際上仍然存在一個小范圍Δθ的波動,而且平均散射角θ并不一定嚴格等于180°,它們會對光譜分析產生一定的影響。
對于較小的顆粒即亞微米量級的顆粒,這種影響可以忽略;但對于較大的顆粒即微米量級的顆粒,這種影響比較明顯。由式\\(1\\)可以推斷:函數G取決于x與sinθ2的乘積,當x較大時,因θ變化產生的影響會比較大;另外,這也可以從Mie散射數值計算來加以理解。
圖1比較了兩種尺度不同的聚苯乙烯微球顆粒在水溶液中其微分散射系數隨角度變化的Mie散射計算結果\\(即散射強度隨角度的變化\\)。這里入射波長為600nm,而聚苯乙烯和水的折射率按照各自的色散關系取值。從圖中可以看到,在θ=180°附近,直徑d=0.5μm顆粒的光強度變化較為平緩,而d=5μm顆粒的光強度變化較為明顯。圖中縱軸取對數坐標。因為不同波長的光散射強度會不同,所以顆粒越大,在θ=180°附近處的光譜變化會越明顯。
2.2基于光纖探頭的光譜獲取及分析
基于光纖探頭的顆粒背向彈性散射光譜獲取會因是否將光纖探頭插入顆粒溶液中以及光纖探頭的具體設計而有所不同。其基本原理如圖2所示,測量系統由一根傳輸光纖和一根收集光纖構成。圖中光纖探頭在顆粒溶液之外,距離溶液面測量高度為h1,為了避免收集到來自溶液面的鏡面反射光,兩根光纖都沿垂直方向旋轉了一個角度β\\(一般取~25°\\)。
如圖2中的插圖所示,只有在兩個光纖數值孔徑\\(NA\\)重疊區域內的顆粒才能夠被探測到。而顆粒的位置不同,其平均散射角\\(π-θ\\)\\(定義為兩個光纖中心的張角\\)以及散射角范圍Δθ\\(定義為每個光纖的張角\\)實際上也不同。但是,當:h2<
由于實際測量中收集到的光強度反比于\\(h1+h3\\)的平方\\(h3代表顆粒所處的深度\\),h1不能過大,否則會導致信噪比過低,因此難以達到式\\(2\\)的條件。此時,θ和Δθ的取值分布較為復雜,給光譜的計算分析帶來了難度。
2.3基于透鏡系統的光譜獲取及分析
由于基于透鏡系統的光譜獲取方法采用平行光照明以及平行光收集,與光纖探頭測量相比,散射角范圍更加明確,光譜分析更為簡明、準確。
圖3為使用立方體分束器\\(BS\\)構成的光譜獲取透鏡系統。其中,透鏡L1將入射光準直為平行光,透鏡L2將背向散射的平行光會聚到收集光纖中。需要注意的是,不能將光纖探頭直接耦合到一個透鏡來實現準直和會聚功能,因為這樣會使透鏡表面的反射光進入到收集光纖中。
在圖3所示的系統中,入射平行光經過分束器的90°反射后,沿平行于分束軸的方向照射到顆粒溶液。由傳輸光纖、透鏡L1、BS、透鏡L2、收集光纖構成的系統需要固定在一起,并沿垂直方向旋轉一個小的角度\\(一般取~25°\\),以避免收集到顆粒溶液表面的反射光。另外,收集光纖還需偏離透鏡L2光軸一個小的位移Δx,這是為了避免收集到分束器表面的反射光。
從圖中虛線畫出的光線平行線輔助線可以看出,進入收集光纖的背向散射光的平均散射角θ\\(定義為到達收集光纖中心的光線在進入透鏡L2之前與分束器軸向的偏轉角\\)為:
其中:f代表透鏡L2的焦距。散射角范圍Δθ\\(定義為到達收集光纖邊緣的光線在進入透鏡L2之前的夾角\\)為:
也就是說Δθ與Δx無關。比較式\\(5\\)與式\\(3\\)、式\\(8\\)與式\\(4\\)可知,相比于光纖探頭系統,透鏡系統的散射角不再受到溶液厚度、測量系統與顆粒溶液間距離的影響,而只由透鏡L2的焦距以及收集光纖的偏離位移和直徑決定。
3、實驗結果及分析討論
3.1實驗樣品
實驗采用標準尺寸聚苯乙烯微球顆粒懸浮制品\\(PSN1005,納微科技\\)稀釋而成的顆粒懸浮溶液。該制品標明的顆粒直徑的平均值為4.955μm,標準方差為0.156μm,初始質量濃度為1%。再將溶液稀釋50倍使質量濃度為0.02%,在此濃度下用Mie散射數值計算可得入射光波長為550nm時,散射系數為μs=0.97cm-1。在光譜測量時,將這個稀釋顆粒溶液攪拌均勻后,倒入底面直徑為35mm的細胞培養皿\\(CORNING 430165\\)中,當倒入1mL顆粒溶液時,溶液厚度h2=1mm\\(見圖2和圖3\\)。在實驗中厚度最大為h2=3mm,這時對應的光學厚度為τ=μsh2=0.291。在這種條件下,忽略顆粒多次散射對測量的影響,認為背向散射光等于各個顆粒的單次散射光的非相干疊加。
3.2光纖探頭測量實驗
在光纖探頭光譜測量實驗中\\(如圖2所示\\),光纖探頭\\(FCR-7UV200-2-ME,Avantes\\)由6根照明傳輸光纖緊密環繞1根收集光纖構成,光纖直徑均為200μm,數值孔徑NA均為0.22。光源采用脈沖氙燈\\(AvaLight-XE,Avantes\\),它耦合到一根600μm光纖的最大功率為180μW。
光譜儀為單通道光纖光譜儀 \\(AvaSpec-2048,Avantes\\),其測量光譜為300~900nm。本文分別取顆粒懸浮溶液厚度h2=1,2mm以及測量高度h1=3,6,9mm,共進行了6次實驗,得到了在3種測量高度下漫反射白色參考瓦\\(WS-2,Avantes\\)的光譜,將其記為參考光譜信號Sref;還探測了相同h2條件下去離子水的光譜信號作為背景信號\\(記為Sbg\\)。最后,獲得的顆粒背向散射信號為:
式\\(9\\)對應于理論中的微分散射系數。
表1列出了6次實驗收集各個信號所用的光脈沖數。將這些光脈沖數進行歸一化后代入式\\(9\\)中,計算結果如圖4所示。
圖4\\(a\\)給出了溶液厚度h2=1mm時,3個不同測量高度的光譜測量結果。為了比較這3個光譜是否因h1的改變而發生變化,圖4\\(b\\)給出了這3個光譜分別除以h2=1mm、h1=9mm時光譜\\(即曲線c\\)的結果。很顯然,最下面的f為一個數值恒等于1的直線。從圖4\\(b\\)可以看到,雖然曲線e并沒有明顯偏離f;但曲線d明顯地偏離f,其主要表現為隨波長的增加而傾斜,而在短波長段仍然保留有圖4\\(a\\)光譜中的周期起伏結構。這表明在測量高度h1有較大變化時,顆粒背向散射光譜不僅有因L而發生的整體改變,而且還有因散射角變化而產生的光譜形狀變化。
為了考察溶液厚度對光譜的影響,圖4\\(c\\)給出了測量高度h1=9mm時,兩種不同測量厚度的光譜測量結果。由圖4\\(d\\)可知,曲線i在短波長段仍然有光譜周期起伏結構。因此,因溶液厚度引起的散射角變化對顆粒背向散射光譜測量有明顯的影響,這與前文的理論分析相符。
3.3透鏡系統測量實驗
基于透鏡的光譜測量系統如圖3所示,實驗選用的光源為強度可調的連續氙燈 \\(TunablePowerArcTM1000,OBB Corporation\\),兩根光纖的直徑均為ρ=400μm、數值孔徑NA=0.22,實驗測得從傳輸光纖出射的光功率為230μW。兩個透鏡的直徑均為25.4mm、焦距f=35.0mm\\(AC254-035-A-ML,Thorlabs Inc.\\),立方體分束器為非偏振型,工作在可見光波段 \\(CMI-BS013,Thorlabs Inc.\\)。如圖所示,設收集光纖偏離位移Δx=800μm。同樣進行了6次實驗,所測的顆粒懸浮溶液厚度h2分別為2,3mm,測量高度距離h1分別為9,12,15mm。表2列出了測量各個信號所用的積分時間,最后在用式\\(9\\)計算光譜時將所有的信號歸一到1ms。
光譜計算結果如圖5所示。從圖5\\(a\\)和圖5\\(b\\)容易看出,溶液厚度對光譜測量結果的影響很小,可以忽略。從圖5\\(c\\)和圖5\\(d\\)可以看到,測量高度變化對光譜形狀也沒有影響:其相除的結果在排除噪聲外接近于一條平直線,在短波長段也沒有出現光譜的周期起伏結構。這是因為測量高度不影響散射角\\(參見式\\(5\\)和式\\(8\\)\\)。以上的實驗結果也很好地符合本文的理論分析。
3.4兩種方法測量光譜的Mie散射計算擬合
背向散射光譜測量的最終目的是獲得微球顆粒的尺寸,包括平均直徑以及直徑的標準方差\\(假設為高斯分布\\),故需要建立一個Mie散射計算數據庫,將測量光譜與各個尺寸的理論計算結果逐一比對,尋找到最佳的擬合結果。由于本文的目的不是為了研究這種尺寸的提取方法,因此這里采用生產廠家提供的顆粒尺寸值作為參考,給出了與測量光譜擬合最好的Mie散射計算結果。
如圖6所示,圖6\\(a\\)和6\\(b\\)分別顯示了光纖探頭測量光譜\\(h2=2mm、h1=9mm\\)、透鏡系統測量光譜\\(h2=2mm、h1=15mm\\)與理論計算的比較。
Mie散射計算所取的顆粒尺寸為平均值d=4.85μm、標準方差Δd=0.034μm,折射率的取值考慮了聚苯乙烯和水的色散,計算時散射角取單一的平均角。由圖2和圖3的幾何關系計算得到,散射角分別為\\(π-0.022\\)和\\(π-0.023\\)\\(為了分析方便,沒有對散射角度范圍取積分計算\\)。圖中的測量光譜和理論計算都做了歸一化,取波長為625nm處的光譜為1。分別將圖6\\(a\\)和圖6\\(b\\)中的實驗測量光譜和理論計算光譜進行互相關計算,得到的相關系數分別為0.93和0.96。由此可知,即使在光纖探頭測量優化條件下,還是透鏡系統測量光譜與理論擬合結果更相符。因此,選用透鏡系統測量光譜再由數據庫搜索方法能得到精度更高的顆粒尺寸結果。
3.5討論
圖4、圖5、圖6驗證了理論分析結果,即透鏡系統測量所獲光譜對應的背向散射角有更好的定義,更有利于光譜的理論計算和顆粒尺寸分析。由于無法完全避免來自立方體內表面的反射光,因此透鏡測量時背景信號所占的比例較大,同時也限制了光譜測量的積分時間。這個問題可以通過采用片狀和楔狀分束器來解決,但表面平行的片狀分束器會帶來由兩表面的反射光相互干涉形成的光譜周期結構,從而干擾光譜分析;而兩表面有小角度夾角的楔形片狀分束器會使得光學系統的同軸調整變得復雜。
從另外一個方面來看,光纖探頭測量不僅具有實驗系統簡單、易于操作的優點;而且當設置測量高度足夠遠、溶液厚度足夠小的時候,背向散射角的定義也會變得更加明確,但這些設置也會導致信噪比的降低。光纖探頭光譜測量的局限性在測量微米量級的顆粒時存在,但對亞微米顆粒的測量可以忽略。
4、結論
本文通過理論分析和實驗驗證,細致地比較了光纖探頭測量和透鏡系統測量這兩種背向散射光譜獲取方法的優缺點。實驗結果表明,在提取微米球形顆粒尺寸時,前一種方法簡便易行,但所獲得的光譜形狀會受到測量高度以及顆粒溶液厚度的影響;后一種方法中不存在這些問題,但其光譜測量的信噪比較低。因此,在顆粒尺寸提取精度要求不高的情況下,可以選用光纖探頭測量方法;在精度要求高時,應選用透鏡測量方法,同時采用濾波去噪聲信號處理的手段來提高顆粒尺寸的提取精度。下一步研究將集中于如何提高透鏡系統光譜測量的信噪比,一種可能的途徑是用反射凹面鏡來取代透鏡,這樣可以在系統中避免使用光分束器,在提高信噪比的同時保留透鏡系統測量的優點。
