B 細 胞激活因子 （ B cell activating factor,BAFF; 又 稱TNFSF13B,THANK,CD257,BLyS 或 TALL1） 是 1999 年發現的腫瘤壞死因子家族中的一員，是與人體免疫有關的細胞因子[1-3].BAFF 由 285 個氨基酸組成，其中 1 ~ 46 位氨基酸為胞內區，47 ~73 位氨基酸為疏水的跨膜區，74 ~ 285 位氨基酸為胞外區。BAFF 位于細胞內的 N 端缺少信號肽，C 端在胞外，屬于Ⅱ型跨膜蛋白[1-2.BAFF 主要表達在先天免疫細胞如單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及濾泡樹突細胞等。目前已知 BAFF 可與 3 種受體相互作用，分別是 B 細胞成熟抗原（ B cell maturation antigen,BCMA）[4-5]跨膜激活物與親環素配體相互作用因子（ transmembrane activator and CAML interactor,TACI）[6]及 BAFF 受 體 （ BAFF receptor3, BAFF-R, 也 叫BR3）[7].其中，BR3 是 BAFF 的特異性受體，而 TACI 和 BCMA同樣也是 TNF 超家族的另一成員 APRIL 的受體。BR3 是唯一可被可溶性 sBAFF 三聚體激活的受體。同許多 TNF 家族成員一樣，sBAFF 多以三聚體型式存在，與其受體相互作用，實現其生物學功能[8].在中性或堿性條件下，20 個三聚體型式的 sBAFF可通過其"Flap 區"相互結合，形成類似病毒顆粒的 60 聚體型式，并可在酸性條件下發生不可逆的分離[9-10].BAFF 的"Flap"環為其特有，其他 TNF 家族蛋白沒有此結構。三聚體形式的配體與其受體結合并不一定會激活下游信號通路，尤其是對于TACI,只有 60 聚體形式的 BAFF 才能激活它介導的生物學效應[11].

研究發現，BAFF 的異常表達與自身免疫性疾病密切相關。

BAFF 表達量的高低影響到 B 細胞的存活信號通路及產生自身抗體的 B 細胞的選擇性凋亡[12].普遍認為 BAFF 過表達與系統性紅斑狼瘡（ systemic lupus erythematosus,SLE） 、類風濕性關節炎（ rheumatoid arthritis,RA） 、干燥綜合征（ Sj\ue56egren's syndrom,SS） 等多種自身免疫性疾病的發生和發展有著密切關系[13-14].因此BAFF 及其受體有望成為治療相關性疾病的新靶點。BAFF 可溶性形式為其發揮功能的主要區域，故本研究旨在對 BAFF 胞外區可溶性片段 134 ~285 位氨基酸殘基進行克隆，構建原核表達載體。通過 IPTG 誘導蛋白表達，經純化及復性得到目的蛋白，為體外研究 sBAFF 的結構與功能關系以及進一步探討其生物學功能奠定基礎，并為以 BAFF 與其受體為靶點的藥物設計提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料

1. 1. 1 菌種和質粒： 質粒 pET21a; 大腸桿菌 E. coli Top10,E. coli BL21（ DE3） 均由本實驗室保存。

1. 1. 2 試劑及耗材： DNA 限制性內切酶 NdeI、XhoI,T4DNA 連 接 酶、DNA Marker 購 自 Takara 公 司； KOD DNAPolymerase 購自東洋紡（ 上海） 生物科技有限公司； DNA 凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自申能博彩生物工程公司； 蛋白胨、酵母浸膏購自 Sigma 公司； IPTG 購自 Sunshine 公司； 丙烯酰胺和雙甲叉丙烯酰胺、TEMED 購 Bio-Rad 公司； Ni2 +-NTAagarose 購自 Qiagen 公司； 透析袋購自南京晚晴公司 （ MW8-10kDa） ; 相關引物由南京金斯瑞生物技術公司合成。

1. 1. 3 實驗儀器： 高速離心機 （ CR22E,日本 HITACHI 公司） ,超聲波細胞破碎儀（ SCIENTZ-II D,寧波新芝生物科技股份有限公司） ,恒流泵（ BT-100,上海滬西分析儀器廠有限公司） ,蛋白質紫外檢測儀（ HD-7,南京普陽科學儀器研究所） ,蛋白凝膠電泳儀（ 美國 Bio-Rad） .

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 sBAFF 基因的擴增： 根據 GenBank 中編碼人 sBAFF的 cDNA 序列，設計一對特異性引物，擴增編碼 134 ~285 位氨基酸序列，上游引物 F 為： 5'-GGAATTCCATATGGTTCAGGGTCCAG-3',下游引物 R 為： 5'-CGGCTCGAGCAGCAGTTTCAATG-3'.其中F 和 R 分別含有酶切位點 Nde I 和 Xho I（ 下劃線標出） ,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以 K562 細胞的 cDNA 為模板，PCR 擴增 sBAFF 基因，反應條件為： 95 ℃ 預變性 5 min;98 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,共 30 個循環； 最后 72 ℃ 10 min.PCR 產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1. 2. 2 重組表達載體 pET21a-sBAFF 的構建及鑒定： 對PCR 得到的片段及載體 pET21a 分別用限制性內切酶 NdeI、XhoI進行雙酶切，利用 T4 DNA 連接酶將 sBAFF 酶切產物連接到pET21a 載體上，并將連接產物轉化到 DH5α 感受態細胞中，涂布于含有氨芐青霉素的 LB 平板上過夜培養。挑取單克隆，進行菌落 PCR 和雙酶切鑒定，鑒定為陽性者提取重組質粒，由南京金斯瑞生物技術公司測序。

1. 2. 3 目的蛋白的表達及條件優化： 將測序正確的重組質粒 pET21a-sBAFF 轉化進大腸桿菌 BL21（ DE3） 中進行誘導表達。

將重組菌接種于含 50 μg/mL 氨芐霉素的 3 mL LB 培養基中，37 ℃ ,220 r / min 培養活化過夜。次日按 1∶100 接種于 50 μg /mL 氨芐霉素的 3 mL LB 培養基中，37 ℃ 、220 r / min 培養至菌體OD600約為0. 6,加入 IPTG 至終濃度1 mM,分別在37 ℃下誘導表達 5 h 和 20 ℃下誘導表達 16 h.誘導結束后取菌液 3 mL,離心去除培養基，PBS 洗滌 2 次后用適量 PBS 重懸。菌液經超聲破碎后（ 超聲功率400 W,超聲2 s,間歇2 s,總時間1 min） ,12000 r/min 離心 5 min,分離上清液和沉淀，沉淀用等量 PBS 重懸。分別取菌液、上清液、沉淀制樣，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，分析目標蛋白的表達量和可溶性情況。

1. 2. 4 Ni2 +-NTA 親和層析柱純化重組蛋白： 確定了目的蛋白適宜的誘導溫度和誘導時間后，分別將含有重組質粒 pET21a-sBAFF 的表達菌在 500 mL LB 培養基中擴增培養并誘導表達。離心收集菌體，PBS 洗滌2 次后用40 mL PBS 重懸，冰浴超聲破碎直至菌液呈半透明，于4 ℃，12000 r/min 離心 15 min,收集包涵體沉淀。向沉淀包涵體加入 4 mL 含有 8 mol/L 尿素和 10 mmol/LPMSF 的 PBS,于冰上攪拌溶解，4 ℃ ,12000 r / min 離心 15 min,留取上清。首先將 Ni2 +-NTA 親和層析柱用 Binding Buffer（ 含有 8mol / L 尿素的 PBS） 平衡。以 0. 2 mL / min 的流速緩慢上樣，使蛋白能夠與柱子充分結合。用 Binding Buffer 平衡柱子 5 個柱體積后，用 Washing Buffer（ 含有8 mol/L 尿素，50 mmol/L 咪唑的 PBS）洗脫雜蛋白。用含有不同濃度咪唑的 Elution Buffer（ 含有 8 mol/L尿素，200/500 mmol/L 咪唑的 PBS） 洗脫目的蛋白。收集各組分的洗脫液進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，分析目的蛋白的洗脫情況。

1. 2. 5 蛋白的透析復性： 將透析袋于含 2% NaHCO3和1 mmol / EDTA 的 溶液中煮 10 min,用 ddH2O 沖 洗干凈，再于1 mmol / L EDTA 的溶液中煮 10 min,用 ddH2O 沖洗干凈。將含有純度較高的目的蛋白的洗脫緩沖液裝入預處理的透析袋中。

復性緩沖液由含不同濃度的尿素 （ 6、4、2、1、0 mol/L） 和0. 1 mmol / L PMSF 的 PBS 組成。目的蛋白在 4 ℃ 經上述尿素濃度不斷降低的復性緩沖液中攪拌透析，每次 8 h,使變性的目的蛋白在此過程中自然復性，從而得到有活性的目的蛋白。透析結束后，經 SDS-PAGE 凝膠電泳鑒定其復性效果。

2 結果

2. 1 sBAFF 基因擴增產物的鑒定 以 K562 細胞的 cDNA為模板，設計含有特定酶切位點的特異性引物，對 BAFF 的 134 ~285 位氨基酸進行擴增，預期擴增產物 sBAFF 大小分別約為 468bp.PCR 產物用 1% 瓊脂糖凝膠進行電泳后，可見條帶清晰單一，片段大小與預期結果一致，結果見圖 1.

2. 2 重組表達質粒的鑒定 經抗生素篩選和菌落 PCR 鑒定得到陽性重組子 pET21a-sBAFF.質粒載體中含有 T7 啟動子序列，采用 T7 引物進行測序。測序結果采用 BLAST 程序進行比對分析，確定與預期相符，成功將"Flap"區進行了有效突變。

2. 3 目的蛋白的表達及條件優化 將構建成功的重組原核表達質粒 pET21a-sBAFF 轉化大腸桿菌 BL21 （ DE3） 后，在1 mmol / L IPTG 濃度下，分別在 37 ℃ 下誘導表達 5 h 和 20 ℃ 下誘導表達 16 h.經 SDS-PAGE 分析表明，目的蛋白在 2 種不同誘導條件下都得到了有效表達，相對分子量約為 18000,在菌體內主要以包涵體形式存在，見圖 2 和圖 3.進一步灰度掃描顯示，在 37 ℃誘導 5 h 下，目的蛋白 sBAFF 的表達量占菌體總蛋白的32. 16% ,其中可溶的 sBAFF 占菌體上清總蛋白的 19. 02% .而低溫 20 ℃誘導 16 h 下，目的蛋白的表達量有所提高，sBAFF 的表達量占菌體總蛋白的 38. 59%,其中可溶的 sBAFF 占菌體上清總蛋白的 30. 89%.說明 20 ℃低溫誘導不僅有利于增加目的蛋白的可溶性表達，而且有利于增加目的蛋白的總表達量。

2. 4 目的蛋白的純化 目的蛋白主要以包涵體的形式存在，分離包涵體沉淀后在變性條件進行蛋白純化。包涵體溶解物經 Ni2 +-NTA 親和層析柱純化，得到純度較高的目的蛋白。對不同咪唑濃度的洗脫收集液進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，結果顯示 sBAFF 在 200 mmol/L 咪 唑 洗 脫 下 蛋 白 純 度 較 高，達 到86. 48% ,見圖 4.因而收集純度較高的目的蛋白進行后續的復性。

2. 5 目的蛋白的復性 對收集的目的蛋白采取逐步降低尿素濃度的方法進行透析，除去蛋白溶液中的尿素，使變性的目的蛋白緩慢地進行自然復性。復性后的目的蛋白經 SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果顯示除了 18 kDa 處的條帶外，在 54 kDa 處可見第二條條帶，從分子量大小估計應為三聚體。因此，復性后的目的蛋白單體形成了有活性的三聚體，見圖 5.而凝膠掃描圖像的灰度分析顯示，經過蛋白復性后有 23. 75%的 sBAFF 聚合成了三聚體。蛋白濃縮后，sBAFF 的三聚體提高到了 38. 14%.最終，目的蛋白總產率為 10. 86 mg/L.

3 討論

BAFF 的異常表達與自身免疫性疾病密切相關，故已成為治療自身免疫疾病的新藥物靶點。目前，BAFF 抑制劑主要是針對類風濕性關節炎、SLE 和多發性硬化癥三類疾病。隨著研究的不斷深入，對于 BAFF 形式多樣性的理解也更加豐富。BAFF相關 的 抑 制 劑 也 從 最 早 針 對 sBAFF 的 特 異 性 抗體藥物Belimumab,發展到其它各種抗體類藥物和融合蛋白類藥物，如atacicept （ TACI-Ig 融合蛋白 ） 等，再到針對 sBAFF 和膜結合BAFF 的 blisibimod 等。

在本研究中，構建了 sBAFF 胞外區的原核表達質粒 pET21a-sBAFF,以期望在體外模擬 BAFF 及其多聚體形式。本文通過摸索不同誘導溫度和表達時間，探究不同表達條件對目的蛋白表達的影響，確定合適的誘導條件，以提高目的蛋白的產量。在 20℃ 下誘導表達 16 h,sBAFF 得以有效表達，其表達量顯著提高，從37 ℃ 下表達占菌體總蛋白的 32. 16% ,提高到 20 ℃ 下 的38. 59% ,表達量提高了約 20% .由于 BAFF 單體分子量較小，且含有一對二硫鍵，因此目的蛋白主要以包涵體形式表達。但是與 37 ℃表達相比，降低表達溫度可提高可溶性蛋白的含量，從 37 ℃下可溶性占菌體上清蛋白的 19. 02%,提高到 20 ℃下的30. 89% ,可溶性蛋白的表達量提高了約 62. 41% .因此，首先對20 ℃ 下表達的可溶性目的蛋白進行純化，利用融合蛋白帶有 His標簽的特征，使用 Ni2 +-NTA 親和層析進行純化。

然而在純化過程中，目的蛋白未能有效結合到 Ni 柱上，可能是由于目的蛋白上融合的 His 標簽在蛋白折疊過程中被包裹在蛋白內部而未能暴露，從而導致不能有效與 Ni 結合。因此，通過對包涵體進行變性溶解，打開蛋白折疊的高級結構，暴露 His 標簽，再使用Ni2 +-NTA 親和層析進行純化得到了純度較高的目的蛋白，為后期研究蛋白活性提供了可能。在對變性蛋白復性透析過程中，采取了逐步降低尿素濃度的方法，使目的蛋白重新緩慢進行正確折疊恢復其生物學活性。而 BAFF 單體內有一對分子內二硫鍵存在，如果二硫鍵發生錯配，則會產生二聚體及基于二聚體的多聚體形式。同時，有活性的 BAFF 是以三聚體的形式存在的，故在復性過程中，BAFF 單體能否有效聚合成三聚體與其恢復生物學活性密切相關，而有無二聚體存在則能夠反映復性過程中是否發生了錯誤折疊。復性后的 sBAFF 經過 SDS-PAGE 分析顯示蛋白主要以單體和三聚體形式存在，有38. 14%的 sBAFF 聚合成三聚體，而代表發生錯誤折疊的二聚體含量極低，約 1. 21%,這說明本實驗的復性工藝是成功的。如何進一步優化復性工藝、獲得更高比例有活性的三聚體尚需進一步努力，以取得更加理想的效果。

本研究中，sBAFF 的成功構建和表達、以及復性工藝的建立，為進一步在體外研究 BAFF 的作用機制奠定了初步的基礎。同時為以 BAFF 為靶點的自身免疫性疾病的新型藥物開發創造了條件。