核糖體作為細胞內重要的細胞器負責蛋白質的合成。核糖體包含大小2個亞基，主要由蛋白質和核糖體RNA（r RNA）構成。在哺乳動物細胞中由RNA聚合酶Ⅰ轉錄47S核糖體RNA前體（pre-r RNA）， 47Spre-r RNA合成后發生甲基化、假鳥苷酸化并在特定的位點被切割產生一系列的中間體，最終產生成熟的18S, 28S和5.8S r RNA, RNA聚合酶Ⅱ轉錄m RNA前體及多數的核內小RNA, RNA聚合酶Ⅲ轉錄t RNA, 5S r RNA等轉錄產物，其中18S r RNA參與構成40S核糖體小亞基，而28S, 5.8S和5S r RNA參與構成60S核糖體大亞基[1].
首先核糖體可以響應環境變化和多種應激信號，其次核仁應激可以破壞核仁功能，干擾核核糖體RNA的合成加工并影響核糖體的組裝，對細胞增殖有重要影響[2].核糖體RNA的合成加工受多種細胞因子的調節，抑癌蛋白ARF（alterative reading frame）對 核 糖 體 的 合 成 有 重 要 調 控 作 用[3], ARF能 與B23/NPM（B23/nucleophosmin）發生相互作用并誘導其降解從而抑制32S r RNA的剪切[4].另外， ARF與聚合 酶 Ⅰ 的 轉 錄 終 止 因 子TTF-1（transcriptiontermination factorⅠ）的核仁定位序列結合影響TTF-1的亞細胞定位導致核糖體的合成抑制[5]. ARF定位于核仁能促進核蛋白的SUMO化修飾[6], SUMO化修飾對底物蛋白的定位、活性和功能有重要調控作用[7],其中ARF介導NPM1（nucleophosmin 1）的SUMO2修飾能抑制28S r RNA的成熟[8].
Apak是KRAB型鋅指蛋白家族成員之一，研究發現， Apak作為p53的負性調控分子，特異地調控p53所介導的細胞凋亡，對細胞周期阻滯沒有顯著影響[9].在癌基因激活的條件下， ARF與Apak相互作用，促進Apak與p53解離，激活p53下游凋亡相關靶基因的表達[10].進一步研究發現， ARF促進Apak移位于核仁，并發生SUMO化修飾； Apak的SUMO化修飾拮抗其泛素化修飾，穩定Apak的蛋白水平[11].
核仁作為蛋白SUMO化修飾和去SUMO化修飾重要的位置， SUMO化修飾的Apak在核仁中發揮的作用是否與核糖體RNA的合成有關？本研究將初步探討SUMO化修飾的Apak對核糖體RNA合成的調控作用。
1材料與方法
1.1材料
（1）質粒。 Myc-Ras V12質粒以及Mcy-SUMO-Apak融合表達質粒均由本實驗室王珊提供。
（2） Si RNA. ARF Si RNA的序列： 5′-CUCG-UGCUGAUGCUACUGA-3′；非 靶 向 對 照 序 列： 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′均 由 上 海Gene-Pharm公司合成。
（3）細胞和菌種。 H1299（非小細胞肺癌細胞）以及菌種DH5a均為本實驗室保存。
（4）主要試劑。 Northern blot試劑盒購自北京華越洋生物科技公司， TRIzol試劑購自美國Sigma公司，實時定量PCR試劑盒購自日本Toyobo公司，放線菌素D購自美國Sigma公司，轉染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，蛋白A/G瓊脂糖凝膠珠購自美國Santa Cruz公司，胎牛血清、DMEM 培養基（dulbecco's modified eagle medium）以及胰酶購自美 國Hyclone公 司，質 粒 提 取 試 劑 盒 購 自 美 國Promega公 司，感 受 態 細 胞DH5a購 自 北 京TIANGEN生化科技有限公司， Apak抗體由國家蛋白質中心田春燕制備， Western blot顯色試劑盒購自美國Pierce公司。
1.2細胞培養及質粒轉染
H1299細 胞 培 養 于 含 有10%的 胎 牛 血 清 的DMEM培養液中，置于37℃， 5% CO2培養箱中培養。待細胞生長至70%融合時用美國Invitrogen公司的轉染試劑轉染，轉染量按照說明書規定的量轉染。
1.3 Northern blot
實驗提取細胞總RNA,制備1%的變性瓊脂糖凝膠和樣品，上樣后50 V電泳約2 h,在紫外燈下觀察RNA的完整性，將RNA從變性膠轉移至尼龍膜上，電轉完將膜在6×檸檬酸鹽緩沖液（saline sodiumcitrate, SSC）中浸泡5 min,膜放置80℃真空干烤10 min,生物素探針標記（探針序列： 5′-CCCCAAG-GCACGCCTCTCAGATCGCTAGAGAAGGCTTTTC-3′），室溫下反應1 h.在預雜交液中預雜交2 h,將變性的探針加入預雜交液雜交3 h,洗膜，在暗室中壓片顯影。
1.4實時定量PCR
將H1299細胞鋪板，外源過表達Mcy-SUMO-Apak質粒， 36 h后收集細胞提取RNA,逆轉錄后得到c DNA模板。實時定量PCR的反應體系為25 μL,包含水、基因引物、Sybr Green Mix以及模板， PCR反應的條件為94℃1 min, 56℃1 min , 72℃1 min,55℃采集熒光信號，每組做3個重復，待反應結束后分析溶解曲線以及擴增效率曲線。引物如下： 18Sr RNA為： 5′-TTTAACGAGGATCCATTGGA-3′和5′-TTACTCGGGAATTCCCTCGT-3′； 5.8S r RNA為：5′-AAGCGACGCTCAGACAGGCGT-3′和5′-CGACT-CTTAGCGGTGGATCAC-3′； 5S r RNA為： 5′-ACGG-CCATACCACCCTGAA-3′和5′-GCCAAAGAAAAA-GCCTACAGCA-3′； t RNASer為： 5′-GCGGAAAGTC-CAGTGATCCA-3′和5′-GGAATCGAACCAGCGAC-CTAAG-3′； Nucleolin為： 5′-TTGCGACGCGTACGA-GCTGG-3′，和5′-ACTCCGACTAGGGCCGATAC-3′； GAPDH為： 5′-GTATTCCCCCAGGTTTACATG-3′和5′-TTCTGTCTTCCACTCACTCC-3′。
1.5 RNA-Ch IP
將H1299細胞培養至90%融合時，加入終濃度為1%的甲醛室溫放置10 min后加甘氨酸終止固定，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）漂洗后將細胞裂解、超聲破碎離心取上清。上清中加入蛋白A/G瓊脂糖凝膠珠清除非特異蛋白，留取10 μL作為input（樣品裂解液上清，未加Apak抗體）備用，在預清除的上清中加入Apak抗體過夜后再加蛋白A/G瓊脂糖凝膠珠放搖床2 h,凝膠珠洗滌后將蛋白質和RNA復合物洗脫， RNA去交聯純化后用于PCR檢測。
1.6 Western blot
