蛋白質在細胞的各種生命活動中扮演了重要的角色，如信號傳導、免疫應答、細胞粘附等。20世紀 70 年代，DNA 重組技術的應用，使蛋白質能在多種宿主細胞中表達[1].總體上，高產率重組蛋白的獲得比較困難且不可預計，尤其是目標蛋白存在翻譯后修飾，如形成二硫鍵。真核生物內的二硫鍵蛋白普遍存在，對人類基因組的預測表明，大約 30%的蛋白定位于內質網，而其中一半數量含有二硫鍵[2].二硫鍵可在構象上固定多肽鏈的骨架或改善其熱動力學穩定性，以抵抗高溫、強酸、強堿等傷害。因此，二硫鍵蛋白常被分泌到細胞外或錨定于細胞膜，它們適于作為治療藥物（如胰島素、抗體）或制藥產業的靶標蛋白[3].工業化生產及科學研究也需要大量的活性蛋白。
真核細胞（酵母、昆蟲、中國倉鼠卵巢細胞）表達二硫鍵蛋白，時間長且花費大，而無細胞表達體系難以實現擴大化生產。大腸桿菌是目前首選宿主菌之一，因其具備生長快、操作簡單、產量高等特點備受人們青睞[3].大腸桿菌中二硫鍵蛋白的形成定位于細胞周質，但蛋白產率低。而大腸桿菌細胞質缺乏真核蛋白表達所需的翻譯后加工機制，因此多數二硫鍵蛋白在細胞質中形成包涵體。
蛋白包涵體只能通過變性、復性等過程獲取一定比例的活性蛋白，且方法繁瑣、產率低下、通用性不強。因此如何改善大腸桿菌細胞的表達環境以獲得高產率的活性二硫鍵蛋白，是科學家們致力于解決的難題。本文介紹了大腸桿菌中二硫鍵的形成機制，并綜述近年來二硫鍵蛋白表達策略的最新研究成果，為富含二硫鍵蛋白在大腸桿菌反應器的重組表達或工業化生產提供理論基礎。
1 大腸桿菌細胞周質二硫鍵的形成
1.1 周質蛋白分泌機制
多數大腸桿菌分泌蛋白首先被合成蛋白前體。它們的信號肽由 Sec 分子識別，根據信號肽的種類，Sec 機制分為翻譯后和共翻譯轉運兩種方式。在前者，細胞質內的伴侶分子 SecB 與前體蛋白結合，并維持蛋白的未折疊狀態直至接觸移位酶。而共翻譯轉運方式是在翻譯過程中蛋白的信號肽由信號識別顆粒 （signal recognition particle,SRP）識別，整個 SRP-核糖體-新生多肽復合物再與 Sec 移位酶結合[4].少數分泌蛋白采取一種雙精氨酸轉運系統 （twin arginine translocation system,Tat），該系統轉運蛋白的信號肽帶有特征性雙精氨酸基序。與 Sec 機制不同，Tat 系統中蛋白以緊密折疊形式經過細胞膜。該系統可能與細菌產生抗生素耐藥性有關[4].
1.2 DsbA/DsbB 氧化系統
轉運至細胞周質的多肽由 Dsb 蛋白（Ds-bA- DsbG）催化形成二硫鍵。肽鏈半胱氨酸的硫醇鹽陰離子首先親和攻擊 DsbA 的活性中心，并與DsbA 形成分子間二硫鍵中間體。該中間體很不穩定，由肽鏈另一個硫醇鹽陰離子親和攻擊而快速釋放，肽鏈形成二硫鍵，DsbA被還原[5].
還原態 DsbA 經 DsbB 的重新氧化實現活性再生，而 DsbB 則通過電子傳遞系統再被氧化。DsbB 是細胞內膜蛋白，它具有 4 個跨膜螺旋的核心區和兩段暴露于細胞周質的柔性區。DsbB有兩對二硫鍵，其柔性區的二硫鍵首先從 DsbA 獲得電子，再傳遞給跨膜區附近的半胱氨酸對[6].該對二硫鍵被還原后，其中一個半胱氨酸可與輔因子醌的芳環形成電荷傳遞復合體。有氧條件下，電子經細胞色素 bo、bd 氧化酶傳遞給氧氣分子，而缺氧時，電子的最終受體改變，由甲基萘醌將電子傳給延胡索酸或硝酸鹽等[7]（圖 1）。
1.3 DsbC/DsbD 異構化系統
DsbA 參與二硫鍵形成反應是快速且非特異的，它傾向于催化順序排布的半胱氨酸對形成二硫鍵。因此蛋白存在多對非連續性二硫鍵時，就容易發生錯誤配對，其在細胞內積累或被降解[9].大腸桿菌存在相應的糾錯機制-周質中的二硫鍵異構酶 DsbC,可識別并幫助錯誤折疊蛋白恢復自然狀態。
體內的 DsbC 是兩個亞基組成的同源二聚體，整體呈 V 形。每個亞基具有二聚體化和硫氧還蛋白兩個功能域，它們依靠一段短的螺旋區連接。DsbC 共有 4 個半胱氨酸，硫氧還蛋白功能域C 端的兩個半胱氨酸形成二硫鍵，穩定 DsbC 的空間結構[10].N 端的半胱氨酸對是 DsbC 的活性中心，它們具有 CXXC 催化模序，并由 DsbD 維持還原狀態。DsbD 是細胞內膜蛋白，它包含 3 個模塊：跨膜功能域 DsbDβ，細胞周質功能域 DsbDα 和 Dsb-Dγ。每個功能域有一對活性半胱氨酸。DsbDβ 的半胱氨酸對首先從細胞質硫氧還蛋白獲取電子，再傳遞到 DsbDγ 功能域，然后經 DsbDα 最終將電子傳遞給 DsbC[11]（圖 1）。DsbD 及其家族蛋白是目前已知的一類將電子從細胞質膜傳遞到細胞周質的氧化還原酶。
事實上，DsbC 并不是 DsbD 的唯一底物。
DsbG 為 DsbC 的同源類似物，它具有 CXXC 催化模序，由 DsbD 維持還原態。最新研究發現[12],除了異構酶活性，細胞周質的 DsbG 還發揮還原酶作用。某些周質蛋白存在單一半胱氨酸，它們暴露于氧自由基環境易生成次磺酸，或被進一步氧化成磺酸而損害蛋白活性。DsbG 表面的負電荷區域適于識別已折疊蛋白，并作為周質還原系統的關鍵因子防止蛋白的單一半胱氨酸遭受氧化損傷。而DsbC 內部排列的疏水氨基酸，似乎更利于它與未折疊蛋白作用并糾正錯配二硫鍵。另外，DsbC 也可作為 DsbG 功能的替補[12].
