骨髓增生異常綜合征（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｓｙｍ\ue011ｄｒｏｍｅ，ＭＤＳ）是一種起源于造血干細胞異?？寺〉难合到y疾病，主要表現為外周血一系或多系血細胞減少，骨髓活檢可見特征性的幼稚前體細胞異常定位病理結構。ＤＮＡ甲基化轉移酶抑制劑（ＤＮＡＭｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＤＮＭＴＩ）的出現為ＭＤＳ患者提供了新的治療策略。
ＤＮＡ甲基化轉移酶 １ａ（ＤＮＡＭｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１ａ，ＤＮＭＴ１ａ）是一種維持 ＤＮＡ甲基化狀態的酶，ＤＮＡ在復制時 ＤＮＭＴ１ａ可以甲基化修飾新合成的子鏈 ＤＮＡ，使 ＤＮＡ維持親本的甲基化狀態。地西他濱（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ，ＤＡＣ）作為一種 ＤＮＭＴＩ可通過降解 ＤＮＭＴ１ａ，降 低 基 因 組 ＤＮＡ５′ｍＣ 水 平。
Ｓｈｏｃｋ等報道了 ＤＮＭＴ１ａ可以通過 Ｎ端的一段信號肽序列定位于線粒體中，與線粒體 ＤＮＡ結合。線粒體 ＤＮＡ編碼的蛋白參與線粒體氧化呼吸鏈的電子傳遞過程，線粒體氧化呼吸復合體功能的異?？梢詫е戮€粒體功能的改變。目前國內外有關ＤＡＣ是否可以通過影響線粒體基因組編碼蛋白的表達，從而改變細胞的功能與狀態的研究較少。本研究的目的在于探討 ＤＡＣ是否存在除基因組整合以外影響線粒體功能的作用。
１材料與方法
１．１材料
１．１．１細胞系ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞受贈于上海交通大學第六人民醫院李曉教授。
１．１．２主要試劑與儀器細胞培養用 １６４０培養基、胎牛血清分別購于美國 Ｇｉｂｃｏ和 Ｈｙｃｌｏｎｅ公司。
ＰＩ、Ｂｒｄｕ、鼠源 ａｎｔｉ\ue011Ｂｒｄｕ抗體、兔抗鼠二抗\ue011ＦＩＴＣ、阿非迪霉素購于美國 Ｓｉｇｍａ\ue011Ａｌｄｒｉｃｈ公司。細胞總ＲＮＡ提取用 Ｔｒｉｚｏｌ購于美國 Ｌｉｆｅｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ公司，反轉錄試劑盒 ｇＥｒａｓｅｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ為日本 Ｔａｋａｒａ公司產。ｑＲＴ\ue011ＰＣＲ所用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ購于日本ＴＯＹＯＢＯ公司，實時定量 ＰＣＲ儀 Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅ４８０為瑞士 Ｒｏｃｈｅ公司產。ＲＯＳ檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。
１．２方法
１．２．１細胞培養及細胞周期同步化ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞系在 ３７℃、５％ＣＯ２條件下培養于含有１００Ｕ／ｍＬ青霉素、１００μｇ／ｍＬ鏈霉素、１０％胎牛血清 １６４０培養基中，間隔２～３ｄ添加１次白介素\ue011３（ＩＬ\ue011３）（ｖ∶ｖ＝１∶１０００），每隔４～５ｄ傳代１次。ＡＰＣ以濃度２ｍｇ／ｍＬ溶解于 ＤＭＳＯ中并保存于 －８０℃超低溫冰箱。將ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞以 ５×１０５個／ｍＬ接種在 ２４孔板中，實驗組 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞添加 ＡＰＣ至濃度為２０μｇ／ｍＬ，對照組 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞添加 ＤＭＳＯ，３７℃、５％ＣＯ２條件下培養 ２４ｈ同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞。
１．２．２采用 Ｂｒｄｕ滲入試驗檢測細胞周期同步化實驗組（ＡＰＣ同步化）細胞與陰性對照組（ＤＭＳＯ）細胞，加入終濃度為１５μｇ／ｍＬ的 Ｂｒｄｕ（溴化脫氧尿嘧啶），細胞培養箱中孵育３ｈ，４℃條件下７０％乙醇固定８ｈ，將固定后的細胞置于 ２ｍｏｌ／ＬＨＣＬ處理３０ｍｉｎ。加抗 Ｂｒｄｕ抗體室溫孵育 １ｈ。用 ＦＩＴＣ標記的兔抗鼠二抗室溫孵育 ３０ｍｉｎ，重懸于含有 ＰＩ的 ＰＢＳ中，流式細胞儀 ＦＬ１、ＦＬ３通道檢測 Ｂｒｄｕ的滲入量。
１．２．３ＤＣＦＨ\ue011ＤＡ檢測 ＲＯＳ的產生將 ＡＰＣ同步化后的 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞分別與不同濃度的 ＤＡＣ作用２４ｈ，實驗組 ＤＡＣ濃度為 １．５、５、１０、１５μｍｏｌ／Ｌ，對照組為無 ＤＡＣ的 ＰＢＳ，ＲＰＭＩ１６４０洗滌細胞 ２次，將細胞重懸于 １０ｍｍｏｌ／ＬＤＣＦＨ\ue011ＤＡ無胎牛血清１６４０中，細胞培養箱中孵育 ２０ｍｉｎ，用 ４℃預冷的Ｈａｎｋ’ｓ緩沖液清洗 ３次，最后用 ４００μＬＨａｎｋ’ｓ緩沖液重懸，采用流式細胞儀 ＦＬ１檢測。
１．２．４ｑＲＴ\ue011ＰＣＲ法檢測線粒體 ＤＮＡ拷貝數及ＮＤ１、ＮＤ６ｍＲＮＡ轉錄變化將同步化的 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞與不同濃度 ＤＡＣ（０、１．５、５、１０、１５μｍｏｌ／Ｌ）作用 ２４ｈ，實驗組 ＤＡＣ濃度為１．５、５、１０、１５μｍｏｌ／Ｌ，對照組為無 ＤＡＣ的 ＰＢＳ。采用 Ｔｒｉｚｏｌ法提取細胞總 ＲＮＡ，使用 ｇＥｒａｓｅｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔａｋａｒａ）試劑盒將總 ｍＲＮＡ逆轉率成 ｃＤＮＡ，以 β\ue011ａｃｔｉｎ為內參行相對定量 ＰＣＲ方法檢測 ＮＤ１、ＮＤ６基因表達。
采用 ＴｉａｎｇｅｎＤＮＡ提取試劑盒提取 １×１０６細胞全基因組 ＤＮＡ，檢測 ｍｔＤＮＡ的相對拷貝數變化，ＨＢＧ為內參基因。以下為 ｑＲＴ\ue011ＰＣＲ所需的引物序列：ＮＤ１：上游：ＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＡＧＣＣＣＡＡＡＣＡＡＴ\ue011ＣＴ，下 游：ＴＴＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡ；ＮＤ６：上游：ＴＧＴＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＴＴＣ，下游：ＧＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＡＡＡＴ，β\ue011Ａｃｔｉｎ：上游：ＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴ，下 游：ＡＧＧＡＣＴＣ\ue011ＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡ；ＭｔＤＮＡ：上游：ＣＡＣＣＣＡＡＧＡ\ue011ＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴ，下 游：ＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴ\ue011ＧＴＴＡ；ＨＢＧ：上 游：ＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴ\ue011ＴＣＡＣＴＡＧＣ，下游：ＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣ\ue011ＡＣＣ，總反應體系為 ２０μＬ，ＰＣＲ反應條件為：９５℃３０ｓ，９５℃ ３０ｓ，不同引物退火溫度設定如下：ＮＤ１、ＮＤ６、β\ue011Ａｃｔｉｎ：５９℃ ，ＭｔＤＮＡ、ＨＢＧ：６０℃，７２℃延伸 ３０ｓ，共 ３８個循環。上述引物擴增片段長度為：ＮＤ１：１４８ｂｐ，ＮＤ６：９１ｂｐ，β\ue011Ａｃｔｉｎ：１３７ｂｐ，ＭｔＤＮＡ：１０８ｂｐ，ＨＢＧ：１２０ｂｐ。根據各基因檢測所得 Ｃｔ值，采用 ２－△△Ｃｔ法計算相對基因表達量。
１．３統計學處理所得數據采用 ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５．０統計軟件分析。多樣本均數比較采用單因素方差分析，實驗組與對照組比較采用 Ｄｕｎｎｅｔｔ\ue011ｔ檢驗，計量資料以 ｘ珋±ｓ表示。Ｐ＜０．０５為差異有統計學意義。
２結果
２．１ＡＰＣ同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞檢測ＡＰＣ將細胞同步化在 Ｇ０／Ｇ１期，細胞無法進入 Ｓ期。由圖 １可見，實驗組經 ＡＰＣ處理后細胞周期 Ｓ期幾乎無細胞存在，而未加 ＡＰＣ處理的對照組 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞按照正常的細胞周期進程，Ｓ期可見有大量細胞存在。
２．２不同濃度 ＤＡＣ對同步化 Ｇ０／Ｇ１期細胞 ＲＯＳ產生的影響見圖 ２。由圖 ２可見，實驗組 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞在５μｍｏｌ／ＬＤＡＣ作用２４ｈ后可以促進同步化的 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞產生 ＲＯＳ，與對照組相比差異有統計學意義（Ｐ＜０．０５）。當 ＤＡＣ濃度為 １５μｍｏｌ／Ｌ時細胞內 ＲＯＳ產生較對照組明顯較少（Ｐ＜０．０５）。
２．３不同濃度 ＤＡＣ對同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞線粒體ＤＮＡ拷貝數及線粒體編碼基因 ＮＤ１、ＮＤ６轉錄的影響與對照組相比，同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ在低濃度ＤＡＣ（１．５、５μｍｏｌ／Ｌ）條件下可促進線粒體 ＤＮA（ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｉａｌＤＮＡ，ＭｔＤＮＡ）拷貝 數 增 加 （Ｐ＜０．０５），但隨著 ＤＡＣ濃度增加，ＤＡＣ對 ｍｔＤＮＡ拷貝數影響不大，見圖３Ａ。在高濃度 ＤＡＣ（１５μｍｏｌ／Ｌ）作用下，同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞 ＮＤ１、ＮＤ６基因轉錄明顯增加，而低濃度 ＤＡＣ對 ＮＤ１、ＮＤ６的轉錄影響不大，見圖 ３Ｂ、Ｃ。
３討論
有研究表明，遺傳異常在腫瘤發生發展中參與重要的作用。ＤＮＡ去甲基化藥物的出現給 ＭＤＳ治療提供了新的策略。地西他濱（ＤＡＣ）作為美國ＦＤＡ批準的兩種用于臨床的 ＤＮＡ去甲基化藥物之一表現出較好的應用前景，部分 ＭＤＳ患者從中受益。目前有研究認為，ＤＡＣ發揮抗腫瘤作用具有濃度依賴性，在低濃度下 ＤＡＣ主要發揮 ＤＮＡ去甲基化作用，使發生甲基化沉默的抑癌基因重新表達，而高濃度 ＤＡＣ則通過基因組 ＤＮＡ整合發揮細胞毒作用。
線粒體是一種存在于胞漿內的細胞器，參與多種生物學過程如能量代謝、自由基產生、鈣離子平衡、蛋白質轉錄后修飾、細胞凋亡等。線粒體ＤＮＡ拷貝數增減或缺失以及線粒體編碼基因的突變可見于多種腫瘤組織中，并與腫瘤的發生進展及預后有關。ＭＤＳ是一種多發于老年患者的血液系統疾病，通過對 ＭＤＳ患者的線粒體 ＤＮＡ測序研究表明，高齡 ＭＤＳ患者線粒體 ＤＮＡ突變頻率增加，且突變多發生于非編碼區域。此外線粒體ＤＮＡ編碼蛋白的表達量以及線粒體 ＤＮＡ的拷貝數增加異常也可見于 ＭＤＳ患者。
本實驗通過體外干預，使 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞同步化在 Ｇ０／Ｇ１期，抑制 ＤＡＣ的 ＤＮＡ整合作用，以此探討 ＤＡＣ是否有對細胞發揮非基因組整合依賴的作用。ＡＰＣ是一種 ＤＮＡ聚合酶抑制，可以特異性結合 ＤＮＡ聚合酶，抑制 ＤＮＡ復制合成從而將細胞周期同步化在 Ｇ０／Ｇ１期。本實驗結果顯示，ＡＰＣ可以很有效地將細胞同步化在 Ｇ０／Ｇ１期。當同步化的 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞給予不同濃度 ＤＡＣ作用后發現，在低濃度（１．５、５μｍｏｌ／Ｌ）下 ＤＡＣ可促進同步化細胞ＲＯＳ產生，但隨著濃度的增加，同步化細胞產生的ＲＯＳ卻低于對照組。線粒體內氧化呼吸電子傳遞是細胞內 ＲＯＳ主要來源。推測可能與 ＤＡＣ改變線粒體功能有關。通過檢測不同濃度 ＤＡＣ對同步化 Ｇ０／Ｇ１細胞線粒體 ＤＮＡ拷貝數以及線粒體基因 ＮＤ１、ＮＤ６（ＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１、６）表達的影響。本實驗結果顯示，低濃度 ＤＡＣ（１．５、５μｍｏｌ／Ｌ）可以促進線粒體 ＤＮＡ拷貝數增加，而高濃度 ＤＡＣ卻無此作用。線粒體 ＤＮＡ復制具有半自主性，且受 ＤＮＡ聚合酶 γ催化亞基（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅγｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔＡ，ｐｏｌｇＡ）調控，ｐｏｌｇＡ基因的甲基化程度與線粒體 ＤＮＡ拷貝數呈負相關。此外，有研究發現，在纖維原細胞在受到內源性或外源性氧化物質刺激后，均可刺激線粒體ＤＮＡ拷貝數增加。本實驗結果顯示，當 ＤＡＣ濃度為 ５μｍｏｌ／Ｌ時，能最大程度促進細胞內 ＲＯＳ產生，而此濃度對線粒體 ＤＮＡ拷貝數影響并非最明顯。由此可見，低濃度 ＤＡＣ引起的線粒體 ＤＮＡ拷貝數增加可能與 ＤＡＣ去甲基化作用有關。隨著濃度增加，ＤＡＣ引起線粒體 ＤＮＡ損傷，使線粒體ＤＮＡ拷貝數減少，抵消了 ＤＡＣ去甲基化作用所致的線粒體 ＤＮＡ拷貝數增加的作用。因此，在高濃度 ＤＡＣ作用，同步化 ＭＤＳ\ue011Ｌ細胞線粒體 ＤＮＡ拷貝數未見明顯改變。雖有研究報道，ＡＰＣ對線粒體功能有影響，但本實驗結果顯示，ＡＰＣ處理組與ＤＭＳＯ對照組相比，線粒體 ＤＮＡ拷貝數無明顯的變化。ＮＤ１、ＮＤ６是已報道的兩個線粒體 ＤＮＡ甲基化轉移酶參與調控的線粒體基因。低濃度 ＤＡＣ對線粒體的 ＮＤ１、ＮＤ６表達無明顯影響，相比之下，高濃度 ＤＡＣ可以促進兩者的表達。因氧化呼吸復合體在線粒體內裝配異?？捎绊懷趸粑滊娮觽鬟f，所以高濃度 ＤＡＣ通過改變線粒體基因 ＮＤ１、ＮＤ６蛋白表達、氧化呼吸復合物裝配異常，從而影響線粒體氧化呼吸電子傳遞，與對照相比，降低ＲＯＳ的產生。
綜上所述，本研究初步探討了 ＤＡＣ存在細胞毒以外的其他作用，不同濃度 ＤＡＣ可以影響線粒體 ＲＯＳ的產生，改變線粒體 ＤＮＡ拷貝數及調節線粒體基因表達等作用，為深入研究 ＤＡＣ的作用機理提供理念依據。
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