近年來，隨著養殖業的快速發展，抗生素被廣泛用作畜禽飼料添加劑，用于預防和治療畜禽疾病，促進畜禽生長。由于抗生素被盲目地過量使用，對環境造成了大量的污染。研究表明，動物體內的抗生素以母體或代謝物的形式隨尿或糞便排出體外的量，約占用藥量的40%～90%［1－3］。以畜禽糞便為主要肥料的有機肥因含有豐富的有機質及氮、磷元素廣泛用于農業生產。對農田土壤、地表和地下水及生態系統中各類生物產生危害，并誘發和傳播各類抗生素耐藥細菌，威脅著人類的健康與生存環境［4－8］。

分屬于青霉素類的青霉素G和普魯卡因青霉素，分屬于磺胺類的磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑，以及分屬于四環素類的土霉素、四環素、金霉素和強力霉素是養殖業常用的抗生素類藥物［9，10］。研究多關注的是這些藥物在地表水或地下水體系，水產品及動物組織中的殘留［11－13］，但對有機肥料中青霉素類、磺胺類和四環素類藥物的殘留研究卻未見報道。因此建立同時測定有機肥料中3類抗生素的方法亟待解決，對我國主要商品有機肥及有機肥原料雞糞、豬糞、污泥等中抗生素類污染的種類和含量篩查和檢測起到一定的積極作用。

目前，抗生素殘留檢測主要的方法有:微生物抑制法、酶聯免疫方法、液相色譜法、液相色譜與質譜聯用法［14－22］。微生物抑制法和酶聯免疫方法屬于篩選方法，操作簡便、快速，成本低，但是微生物抑制法檢測時間較長，易受到其他抗生素的干擾，常缺乏專一性和精確度，酶聯免疫方法存在一定的假陽性，需要其他方法進行確認［12］。液相色譜法是較常用的方法，具有分離效果好，測定精度高的優點，但前處理比較復雜。隨著質譜技術的發展，液相色譜－質譜聯用法正越來越廣泛地應用于抗生素殘留的分析中，其分析范圍廣，背景干擾少，靈敏度高，結果精確可靠，將是抗生素殘留檢測的首選方法。因此本研究采用高效液相色譜－串聯質譜法\\(HPLC－MS/MS\\)同時測定了有機肥料中青霉素G、普魯卡因青霉素，磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑，土霉素、四環素、金霉素和強力霉素。到目前為止，國內尚未見高效液相色譜－串聯質譜聯用同時測定以上抗生素殘留的報道。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器:Agilent1200高效液相色譜－API2000三重四極桿串聯質譜聯用儀，配備電噴霧\\(ESI\\)離子源;Biofugestratos離心機;Votex2渦旋儀;固相萃取裝置;StrataSDB－L固相萃取小柱。TTL－DCII型氮吹儀，KQ－300DE型超聲儀，THZ－D型振蕩儀。

試劑:甲酸、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純，購自美國Fisher公司;檸檬酸、磷酸氫二鈉等其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司;試驗用水均為超純水;Na2EDTA－McIlvaine緩沖液\\(0.1mol/L，pH=4.0\\)。

選擇3種較常用的磺胺類藥物:磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑;選用4種四環素類抗生素:土霉素、四環素、金霉素、強力霉素;青霉素類抗生素:選用青霉素G和普魯卡因青霉素。上述藥物均購自Dr.EhrenstorferGmbH公司，純度均不低于96.0%。

1.2標準溶液和緩沖液的配制

標準溶液:分別精確稱取各種標準抗生素10mg\\(精確到0.0001g\\)于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，即得到濃度為1000mg/L的標準貯備液，4℃冰箱內保存。標準工作溶液用超純水稀釋貯備液，現配現用。

Na2EDTA－McIlvaine緩沖液\\(0.1mol/L，pH=4.0\\):將21.01g檸檬酸，44.78gNa2HPO4·12H2O和60.5gNa2EDTA·2H2O溶于1.625L水中。

1.3實驗方法

1.3.1樣品提取與凈化

將有機肥料樣品混勻，稱取1.0g樣品于50mL離心管中，加入2×15mL\\(2次提取，每次15mL\\)pH=4.0的Na2EDTA－McIlvaine緩沖溶液，渦旋混勻，超聲10min后再振蕩提取10min，10000r/min高速離心10min，上清水層直接轉入活化好的StrataSDB－L固相萃取小柱\\(500mg/6mL，預先用5mL甲醇、5mL水和5mL緩沖液平衡\\)。同時收集所有流出液，用20mL乙酸乙酯振蕩提取10min后轉移提取液于100mL離心管中。固相萃取小柱抽干后用10mL甲醇、5mL乙腈和5mL乙酸乙酯洗脫，合并所有洗脫液于前述100mL離心管中，4500r/min離心5min后將上清液轉入雞心瓶，濃縮近干后用氮氣于50℃吹干，用乙腈/0.1%的甲酸水溶液\\(體積比50/50\\)定容至1.0mL，過0.22μm濾膜，待測。

1.3.2檢測條件

色譜條件:AgilentXDBC18色譜柱\\(150mm×4.6mm，5μm\\);流動相A為0.1%甲酸水溶液;流動相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～4.0min，70%～10%A;4.0～9.0min，10%A;9.0～9.1min，10%～70%A;9.1～13.0min，70%A;柱平衡時間8min。流速0.3mL/min;柱溫:室溫;進樣量:10μL。

質譜條件:多反應離子監測\\(MＲM\\)掃描;離子源溫度TEM:450.00℃;電噴霧電壓IS:+5500V;－4500V;氣簾氣CUR:25.00psi;霧化氣GS1:45.00psi;干燥氣GS2:65.00psi;碰撞氣CAD:7.00psi\\(所用氣體均為氮氣，純度99.999%\\);掃描方式:0～9.2min為正離子掃描，9.2～13min為負離子掃描。其他質譜參數見表1。

2結果與分析

2.1提取液的選擇

在選擇提取液時，首先考慮競爭性螯合劑作為提取溶液，因此本文選取了Na2EDTA－McIlvaine緩沖溶液作為樣品提取液，由于酸性溶液比較適合樣品中抗生素的提取，但是當pH＜2時，四環素類抗生素容易分解，因此本實驗選擇了pH=4的Na2EDTA－McIlvaine緩沖溶液作為樣品中抗生素的提取液，實驗結果證明Na2EDTA－McIlvaine對于9種抗生素的萃取效果同樣很好。

2.2凈化條件的選擇

有機肥料成分復雜，天然有機質\\(主要為腐植酸\\)含量較高，對檢測的影響很大。因而凈化提取液十分必要，本實驗采用固相萃取凈化技術對樣品提取液進行凈化。StrataSDB－L固相萃取填料的主要成分是聚苯乙烯－二乙烯基苯聚合物，適合于大多數有機化合物提取，pH范圍更寬，無二級副反應存在，與傳統的C18反相萃取柱相比，除雜質效果更好，操作性能更為穩定。本實驗比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為洗脫液，結果表明，10mL甲醇、5mL乙腈和5mL乙酸乙酯依次洗脫，凈化效果較好，回收率高。

2.3流動相的選擇

一般來說，通常選用乙腈和甲醇作為流動相中的有機相。由于本實驗采用電噴霧模式，去溶劑化十分重要，因乙腈比甲醇更容易氣化，所以選擇乙腈為流動相中的有機相。大部分抗生素類藥物在水溶液中以離子狀態的形式存在，提高離子化效率，可以增強待測物在反相色譜柱上的保留，提高其分離度及改善其峰形，通常在流動相中加入酸性物質\\(如甲酸、乙酸等\\)或緩沖鹽\\(如甲酸銨、醋酸銨等\\)，因此本實驗選用了含有0.1%甲酸的水溶液做流動相中的水相。

2.4質譜條件的選擇

對于串聯質譜，一個母離子和兩個特征子離子即可滿足質譜確證的需要。在本實驗中，除青霉素G在電噴霧負離子檢測模式下進行一級質譜掃描\\(Q1掃描\\)，土霉素、四環素、金霉素、強力霉素、普魯卡因青霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑均在正離子檢測模式下進行一級質譜掃描，分別確定其分子、離子，然后分別對其分子、離子進行二級掃描\\(子離子掃描\\)，選擇最佳子離子，選取豐度較高的兩個離子作為定性和定量離子，然后對離子源溫度、電噴霧電壓、氣簾氣、霧化氣、干燥氣、碰撞氣等質譜參數進行優化。本方法所得到的土霉素、四環素、金霉素、強力霉素、普魯卡因青霉素、青霉素G、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺噻唑的離子流色譜圖如圖1。

2.5線性范圍和方法檢出限

用空白基質溶液制備濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0mg/L的各抗生素混合基質標準溶液，按上述離子掃描方法進樣測定，以濃度為橫坐標，定量離子的色譜峰面積為縱坐標分別繪制各抗生素的標準曲線，得到抗生素的線性方程、相關系數和檢出限，結果見表2。表2表明，以上抗生素藥物在0.05～5.0mg/L濃度范圍內呈現良好線性，相關系數均大于0.99。且上述條件下四環素類藥物的方法檢出限均可達到0.05mg/kg，磺胺類和青霉素類藥物的方法檢出限可達0.02mg/kg。

2.6準確度和精密度試驗

選取樣品加標，加標水平分別為0.1、0.5、1.0mg/kg，每個樣品重復測定5次，考察本方法的準確度和精密度。結果見表3。有機肥料中抗生素的平均回收率在63.1%～93.4%之間，相對標準偏差為1.7%～9.5%?；厥章屎途芏鹊染鶟M足分析要求。

2.7實際樣品分析

應用本方法對20個樣品進行了測定，樣品為豬糞、雞糞、牛糞等畜禽糞便，采自各城區肥料銷售點、肥料生產廠。結果重復性良好，部分四環素類和磺胺類抗生素有檢出，土霉素含量為0.052～0.383mg/kg，四環素含量為0.061～0.164mg/kg，磺胺二甲嘧啶含量為0.027～0.149mg/kg。

3結論

本文建立了同時測定有機肥料中3類9種抗生素殘留的高效液相色譜－串聯質譜法，并對樣品的分析條件進行了優化。結果表明，該方法具有靈敏度高、選擇性強、快速等優點，可用于有機肥料中9種抗生素殘留的同時檢測，為檢測有機肥料中抗生素殘留提供了技術支持。