隨著人們生活水平的提高,公眾對食品安全的關注越來越高,土壤的生物安全性也逐漸進入人們的視野.細菌感染性疾病有許多是因為食用了被污染的新鮮水果或蔬菜而造成的[1-3].其中與土壤相關的病原體,如病原性大腸桿菌,特別是血清型為 O157:H7 的大腸桿菌\\(Escherich coli O157:H7\\),可能給人們的身體健康帶來嚴重的威脅[4-5].Wang 等人發現,E.coli O157 能在牛糞便存活長達 70 天[6],而牛糞等制成的堆肥施用于土壤,有可能造成土壤污染.目前,對 E.coliO157 的研究主要都集中在醫學、水環境和有機廢物上,但對土壤中大腸桿菌生存狀況的研究則較少[7-9].本研究用環境污染指標菌--大腸桿菌作為研究對象,在實驗室驗證大腸桿菌在土壤中的熱耐受性及其影響因素, 以評估 E.coli K12和 E.coli O157 的生存條件.
1 材料與方法
1.1 供試土壤
采集的土壤在 105℃下干燥 10 h,在干燥器中通過孔徑 1mm 的篩子過篩后,放入試劑瓶中,在 121℃高壓鍋中滅菌15 min,最后儲存在 4℃的冷藏柜中以供使用.為了獲得均勻穩定含水率的供試土壤,使接菌均勻,在大腸桿菌接種的前一天,在土壤中定量加入無菌蒸餾水,分別獲得含水率 70%和 40%的兩種供試土壤.
1.2 菌液的調制
以 E.coli K12 菌株\\(非病原性,來自于日本佐賀大學農學部土壤環境研究室\\)和 E.coli O157 菌株\\(病原性,來自于日本產業醫科大學產業保健院微生物研究室\\)作為供試菌株.接種前一天,將保存的 E.coli K12 和 E.coli O157 菌株接種在NB\\(Nutrient broth\\)培養基上,在 37℃下經 18 h 和 24 h 培養后,分別得到對數生長期\\(OD 660,0.35 mmol\\)和穩定生長期\\(OD660,0.50 mmol\\)的菌液.上述菌液用離心機\\(9000×g,12000 rpm\\)離心 10 min 后,除去菌液中的培養基,加入無菌生理食鹽水\\(0.85% NaCl \\)制成菌體的懸浮液,調整至恰當的濃度\\(約 109cfu/mL\\).
1.3 接種和細菌計數取
100mLE.coliK12或E.coli O157的懸浮液\\(109cfu/mL\\),分別接種到 0.9 mL 無菌生理鹽水溶液、0.9 g 含水率為 70%和 40%的土壤中,浸入 60℃恒溫水浴中,受熱時長分別為 0、1、2、3、6 和 10 min,進行熱耐受性測定.熱處理過的樣品加入 10 mL 無菌生理鹽水,分散處理\\(15000 rpm,15 min\\)后,用無菌生理鹽水稀釋到適宜的濃度,接種到 NA \\(NutrientAgar\\)培養基,在 37℃下培養 18~24 h,計算菌數.
2 結果與討論
2.1 不同條件下大腸桿菌的熱耐受性
接種到無菌生理鹽水溶液土壤中的 E.coli K12 和 E.coliO157 在 60℃條件下熱耐受性如圖 1 所示.E.coli K12 在對數生長期的情況下,從初始濃度 108cfu/g 下降到 100cfu/g,在無菌生理鹽水約需要 2 min,在含水率 70%土壤中下降更慢,約需 3 min,而在含水率 40%的土壤中,即使經過熱處理 10min 后,仍有 103cfu/g 菌體存活\\(圖 1. A\\).類似的結果也發生在穩定生長期的菌體中,但是穩定生長期的 E.coli K12菌體熱耐受性明顯高于相同的條件下的對數生長期菌體\\(圖1. B\\).E.coli O157 熱耐受性的情況與 E.coli K12 相似,但其熱耐受性比 E.coli K12 強,即 E.coli O157 的存活率更高\\(圖 1. C、D\\).綜其結果,在高溫條件下,大腸桿菌在含水率低的土壤中比在含水率高的土壤中熱耐受性強,在穩定生長期的大腸桿菌比在對數生長期的熱耐受性更強,E.coliO157 菌株比 E.coli K12 菌株熱耐受性更高.結果表明,含水率大小是大腸桿菌熱耐受性的重要影響因素,顯示了在高溫環境下,對大腸桿菌來說,土壤含水率越低,存活率就越高.
2.2 D 值的計算
D 值\\(Decimal reduction time,DRT\\)是指一定的熱力致死溫度條件下細菌密度降低至初始密度的 1/10 所需的時間\\(即死亡 90%所需時間\\).根據圖 1 所示的熱耐受性曲線,計算出 E.coli K12 和 E.coli O157 的 D 值如表 1.
在生理鹽水、70%含水率土壤和 40%含水率土壤中,60℃下對數生長期 E.coli K12 的 D 值分別為 15.0、15.4 和 109.9sec,E.coli O157 的 D 值分別為 17.2 、40.0 和 136.4 sec.同樣,在同一溫度下的穩定生長期 E.coli K12 的 D 值分別為22.1、29.0 和 122.4 sec,E.coli O157 為 30.4、61.6 和 215.9 sec.
40%含水率土壤中的大腸桿菌 D 值遠高于在鹽水中和 70%含水率土壤中的大腸桿菌 D 值,穩定生長期大腸桿菌的 D 值比在對數生長期高.結果表明,含水率 40%土壤中的 E.coliO157 的 D 值是含水率 70%土壤中的 3 倍,而 E.coli K12 則是 3~6 倍,換言之,在低含水率土壤中可以提高大腸桿菌的熱耐受性,這表明溫度以外,適當的水分管理也同樣重要.
據報道,60℃致死溫度下殺滅大腸桿菌的必要時間介于15~20 min,55℃下需要 1 h[10].從上述得到的 D 值計算,大腸桿菌從 108cfu/g 下降到 100cfu/g,E.coli K12 需時 16.3min,E.coli O157 需時 28.8 min,與已有的報道大體一致.因此在理論上,所有的大腸桿菌細胞在土壤溫度高于 55℃時應該在幾個小時后被殺滅,然而事實上,一些土壤環境中的大腸桿菌,即使溫度高達 54℃~67℃仍然能夠存活下來[11],這用土壤含水率低和處在穩定生長期等理由還不能完全解釋,可能還有其他影響因素,比如 VBNC 狀態而導致大腸桿菌殘存于土壤.
3 結論
在熱處理過程中,高含水率土壤中的大腸桿菌比低含水率土壤中的大腸桿菌熱耐受性低,對數期大腸桿菌比穩定期的熱耐受性低,E.coli K12 比 E.coli O157 的熱耐受性低.基于 D 值計算,E.coli K12 和 E.coli O157 的完全致死時間分別是 16.3 min 和 28.8 min.
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