在農業生產中由害蟲造成的損失占農作物損失總量的１５％以上，因此害蟲防治是農業生產中的一項重要任務。昆蟲病微生物及其代謝產物已成為生物農藥的重要組成部分。蘇云金芽胞桿菌（Ｂａｃｉｌ－ｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ）是目前世界上研究最為深入、應用面積最廣、且應用最成功的殺蟲微生物。自ＳｃｈｎｅｐｆａｎｄＷｈｉｔｅｌｅｙ分離克隆了第１個Ｂｔ殺蟲晶體蛋白基因（ｃｒｙ基因）至今，已經克隆了６２０個ｃｒｙ基 因，ｃｒｙ１類 基 因 數 目 最 多，占２４４種。
ｃｒｙ１Ｉ基因是一類十分特殊的ｃｒｙ１類基因，該類基因編碼蛋白只有８１ｋＤ，不同于大多數Ｃｒｙ１蛋白的１３０ｋＤ。已公布的ｃｒｙ１Ｉ類基因主要為ｃｒｙ１Ｉａ、ｃｒｙ１Ｉｂ、ｃｒｙ１Ｉｃ等６類共５０種，其中ｃｒｙ１Ｉｂ類有１１種。Ｔａｉｌｏｒ等從Ｂｔ菌株４８３５中克隆了第１個ｃｒｙ１Ｉ基因ｃｒｙ１Ｉａ１，發現其對鞘翅目的馬鈴薯甲蟲（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）和鱗翅目的歐洲玉米螟（Ｏｓｔｒｉｎｉａｎｕｂｉｌａｌｉｓ）具有毒殺活性。后來發現的ｃｒｙ１Ｉａ基因對鞘翅目昆蟲均未表現活性。迄今為止，所發現的ｃｒｙ１Ｉ基因所表達的殺蟲蛋白主要對鱗翅目夜蛾科 （Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、卷葉蛾科（Ｔｏｒｔｒｉ－ｃｉｄａｅ）、菜蛾科（Ｐｌｕｔｅｌｌｉｄａｅ）和鞘翅目葉甲科（Ｃｈｒｙ－ｓｏｍｅｌｉｄａｅ）的 害 蟲 表 現 出 殺 蟲 活 性。 另 外，ｃｒｙ１Ｉ類基因在Ｂｔ菌株中多數是沉默的，如ｃｒｙ１Ｉａ１基因在菌株４８３５中就未見表達產物。
ｃｒｙ１Ｉ基因沉默的主要原因可能是，其基因編碼區上游與ｃｒｙ１類基因相鄰，形成ｃｒｙ１－ｃｒｙ１Ｉ連鎖，造成了ｃｒｙ１Ｉ基因自身啟動子的缺乏。
近年來的研究發現，ｃｒｙ１Ｉ類基因除了具有較強的殺蟲活性和相對較廣的殺蟲譜，其表達產物與Ｃｒｙ１Ａ類蛋白無交互抗性，這將為解決Ｂｔ毒素殺蟲譜較窄、害蟲抗藥性產生等問題，提供新的備選基因，因此，ｃｒｙ１Ｉ類基因的研究具有重要的理論意義和實用價值。
ＧＳ８是本實驗室自行分離的野生菌株，經ＰＣＲ－ＲＦＬＰ鑒定含有ｃｒｙ１Ｉｂ基因。本研究克隆了該基因，對其進行了序列比對分析，并在大腸桿菌中進行了表達，測定了其基因表達產物對幾種主要農業害蟲的活性，發現該基因對小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）具有高毒力。
１材料和方法
１．１材料
１．１．１菌株與質粒所用菌株和質粒見表1.
１．１．２培養基ＬＢ液體培養基：Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１．０％，Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ０．５％，ＮａＣｌ１．０％，ｐＨ７．０。ＬＢ固體培養基：在液體ＬＢ培養基中加入１．２％瓊脂粉。
１．１．３酶和生化試劑ＰＣＲ相關試劑購自上海生工。限制 性 內 切 酶、Ｔ４ ＤＮＡｌｉｇａｓｅ、ＤＮＡＦｒａｇ－ｍｅｎｔＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ均購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。
１．１．４供試昆蟲甜菜夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａ）、棉 鈴 蟲 （Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａａｒｍｉｇｅｒａ）和 粉 紋 夜 蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）均由河北農業大學昆蟲病理與分子生物學實驗室提供；小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）由河北省植物保護研究所提供；家蠶（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）品種為菁松×皓月，購于山東廣通蠶種集團有限公司。榆蘭葉甲（Ｐｙｒｒｈａｌｔａａｅｎｅｓｃｅｎｓ）采集于野外。
１．２方法
１．２．１Ｂｔ質粒的提取采用改進的ＣＴＡＢ方法，參見文獻［１５］。ｃｒｙ１Ｉ基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ鑒定、Ｂｔｃｒｙ基因和陽性轉化子的篩選參考宋福平等方法。
１．２．２大腸桿菌分子克隆與檢測Ｅ．ｃｏｌｉ質粒ＤＮＡ提 取、ＤＮＡ酶 切、連 接、轉 化、表 達 產 物 和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測參照文獻［１５］。
１．２．３ＢｔＧＳ８菌株中的ｃｒｙ１Ｉｂ基因的ＰＣＲ擴增、克隆和表達參考ＧｅｎＢａｎｋ中公布的ｃｒｙ１Ｉｂ類基因編碼區的５＇端和３＇端序列，設計引物：
以ＧＳ８的質粒ＤＮＡ為模板，利用高保真ＤＮＡ聚合酶進行ＰＣＲ擴增。
ＰＣＲ反應條件：９４ ℃預變性４ｍｉｎ；９４ ℃變性１ｍｉｎ；５６．５ ℃退火１ｍｉｎ；７２℃延伸１ｍｉｎ４０ｓ，３２個循環；最后７２ ℃延伸１０ｍｉｎ?；厥眨校茫耶a物，將目的片段用ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ進行雙酶切，與以同樣酶切處理過的ｐＥＴ２１ｂ進行連接，轉化大腸桿菌ＴＧ１，以ＰＣＲ和限制性酶切篩選獲得陽性重組克隆。
１．２．４ｃｒｙ１Ｉｂ基因測序和分析選取陽性重組克隆進行序列測定，ＤＮＡ測序工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，采用ＤＮＡＭＡＮ、ＤＮＡ－ＳＩＳ等軟件和ＥｘＰＡＳｙ數據庫分析序列。
１．２．５ｃｒｙ１Ｉｂ基因在大腸桿菌中表達將含有ｃｒｙ１Ｉｂ全長基因的重組質粒導入大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３），以ＩＰＴＧ進行誘導，獲得ｃｒｙ１Ｉｂ基因的正常表達。誘導條件參見Ｎｏｖａｇｅｎ公司產品說明。
１．２．６Ｃｒｙ１Ｉｂ蛋白殺蟲生物活性測定棉鈴蟲、粉紋夜蛾和甜菜夜蛾采用飼料表面覆蓋法進行生物測定：將飼料平鋪于２０ｃｍ２小盒底部，然后將１００μＬ菌液均勻涂布于飼料表面，風干，每盒１０頭試蟲，重復５次。置于２６．５℃培養箱中，每２４ｈ檢查一次活蟲數量（以不能順利進入２齡視為死亡）。家蠶和小菜蛾采用浸液法，將待測菌株按預先設計好的濃度，用無菌水稀釋，用清水作為陰性對照。將新鮮葉片清洗，晾干；分別在Ｂｔ菌液中浸潤１０ｓ取出，晾干，放入廣口瓶中（每片葉柄裹無菌水浸濕的脫脂棉進行葉片保鮮）；每瓶接蟲１０頭（每個處理１０頭蟲，５次重復）初孵幼蟲。放入２５℃光照培養箱培養，分別于７２ｈ后進行調查。榆蘭葉甲參見張杰等方法。測定結果用Ａｂｂｏｔｔ公式計算死亡率。ＬＣ５０和９５％置信應用ＰＯＬＯ軟件計算得出。
２結果和分析
２．１全長ｃｒｙ１Ｉｂ基因的擴增及克隆
以ＧＳ８菌株質粒ＤＮＡ為模板，用上述引物進行ＰＣＲ擴增（圖１），再經限制性酶切和測序鑒定，證明該菌株含有ｃｒｙ１Ｉｂ的基因。通過ＰＣＲ擴增，從ＧＳ８菌株克隆到全長為２．１６ｋｂｃｒｙ１Ｉｂ全長基因，經ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ酶切插入表達載體ｐＥＴ－２１ｂ中，獲得重組質粒命名為ＴｐＥＴ－１Ｉｂ（圖２）。
２．２序列測定及分析
將ＴｐＥＴ－１Ｉｂ進行測序得到ｃｒｙ１Ｉｂ基因的全長 片 段 核 苷 酸 序 列，在ＧｅｎＢａｎｋ登 錄 號 為ＥＵ６７７４２２，并由國際Ｂｔ－δ－內毒素基因命名委員會命名為ｃｒｙ１Ｉｂ３。推測了該基因由７１９個氨基酸組成，氨 基 酸 組 成 分 析 表 明 亮 氨 酸 （Ｌｅｕ）、絲 氨 酸（Ｓｅｒ）和蘇氨酸（Ｔｈｒ）含量最高，分別為８．９０％，８．６２％，７．９３％；該蛋白預測分子量為８１．３７２ｋＤａ，等電點為ｐＩ６．２１５，屬于弱酸性蛋白。
通過ｖｅｃｔｏｒＮＴＩ軟件分析，結果表明，該蛋白與已公布的６種Ｃｒｙ１Ｉｂ蛋白的氨基酸序列存在差異（表２），是一種新的Ｃｒｙ１Ｉａ蛋白，２００９年國際Ｂｔ殺蟲晶體蛋白命名委員會將其命名為Ｃｒｙ１Ｉｂ３。
通過用ＮＣＢＩＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＤａｔａｂａｓ分析Ｃｒｙ１Ｉｂ３保守結構域，結果表明，其ＤｏｍａｉｎⅠ是由Ｎ端第６０～２８０位、共２２１個氨基酸殘基組成，Ｄｏ－ｍａｉｎⅡ由第２８７～４９７位、共２１１個氨基酸殘基組成，ＤｏｍａｉｎⅢ由第５０７～６４４位、共１３８個氨基酸殘基組成，因此，Ｃｒｙ１Ｉｂ３蛋白的活性區估計應位于Ｎ端的第６０～６４４個氨基酸殘基區域（見圖３）。
利用同源建模方法構建了Ｃｒｙ１Ｉｂ３蛋白的三級結構，顯示如圖５。
２．３ｃｒｙ１Ｉｂ３基因的表達
將陽性克隆重組質粒ＴｐＥＴ－１Ｉｂ轉化到大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，經過誘導獲得正常表達。對誘導１～２４ｈ的目的蛋白樣品進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，可見約８１ｋＤ的目的蛋白隨誘導時間的延長，蛋白表達量 逐 漸 增 多，到 第６小 時 達 到 最 大，經Ｉｍ－ａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ軟件分析，約占總蛋白的４５％，同時有６５ｋＤａ的蛋白產生（見圖５）。
２．４殺蟲生物活性測定
由ｐＥＴ２１ｂ表達的Ｃｒｙ１Ｉｂ３蛋白對小菜蛾有很強的殺蟲活性，ＬＣ５０值為０．０７６３μｇ／ｍＬ，對其它試蟲沒有活性（見表３）。
３討論與結論
本研究利用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ體系，在野生菌株ＧＳ８中鑒定出ｃｒｙ１Ｉｂ基因。在此基礎上，從ＧＳ８中克隆了ｃｒｙ１Ｉｂ基因，并在大腸桿菌中成功的表達了８１ｋＤ的重組蛋白。ｃｒｙ１Ｉｂ３基因表達產物經ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，發現為多條帶，產物并不是單一的，分析其編碼區序列發現，同一讀碼框下，不同的起始密碼子共用一個終止子，可能是由于在不同起始密碼子處翻譯所致，也有可能是由于表達蛋白自然降解所致，這有待于進一步研究。而用ｃｒｙ１Ｉｂ３表達產 物 對 供 試 昆 蟲 進 行 生 物 活 性 測 定，發 現Ｃｒｙ１Ｉｂ３蛋白對重要的蔬菜害蟲小菜蛾顯示了高毒力，而對棉鈴蟲、甜菜夜蛾、粉紋夜蛾、家蠶和榆蘭葉甲等未表現出殺蟲活性。據報道，由于蛋白自身結構的差異，８１ｋＤ的Ｃｒｙ１Ｉ類與Ｃｒｙ１Ａｂ等１３０ｋＤ的Ｃｒｙ１Ａ類蛋白不存在交互抗性。因此，本研究發現的ｃｒｙ１Ｉｂ３新基因將為我國抗蟲轉基因作物和工程菌的研制，提供新的基因來源，為篩選、延緩和克服昆蟲產生抗性的基因組合提供了重要材料，具有重要的理論和實踐意義。
國內外的研究結果證明ｃｒｙ１Ｉ類基因在野生菌株中通常是沉默的，如ｃｒｙ１Ｉａ基因在功株４８３５中就沒有表達產物。在ｃｒｙ１Ｉ基因編碼區上游一般與ｃｒｙ１類基因相鄰，稱為ｃｒｙ１－ｃｒｙ１Ｉ連鎖，造成了ｃｒｙ１Ｉ基因自身啟動子的缺乏，這種現象在Ｂｔ菌株中普遍存在，是ｃｒｙ１Ｉ基因沉默的主要原因。
由此以殺蟲活性來篩選菌株的傳統方法無法發現該類基因的存在。實際上，ｃｒｙ１Ｉ類基因廣泛存在于Ｂｔ菌株中。無論是第１個克隆的對鱗翅目和鞘翅目害蟲具有雙重活性ｃｒｙ１Ｉａ基因，還是宋福平等克 隆 的ｃｒｙ１Ｉｅ基 因以 及 本 實 驗 室 克 隆 的ｃｒｙ１Ｉｂ３基因，該類沉默基因表達產物均對鱗翅目等害蟲具有很高的活性，目前，一些ｃｒｙ１Ｉ類基因正應用于抗蟲轉基因植物的研制。研究結果表明，作為重要殺蟲微生物的Ｂｔ菌株而言，其沉默基因資源有著巨大的研究潛力，引起了國內外學者們的關注，有望成為今后Ｂｔ研究新的熱點。
參考文獻：
［１］ＳｃｈｎｅｐｆＨＥ，ＷｈｉｔｅｌｅｙＨＲ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓ－ｓｉｏｎｏｆｔｈｅＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＣｒｙｓｔａｌＰｒｏｔｅｉｎＧｅｎｅｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｉＡｃａｄＳｃｉ，１９８１，７８（５）：２８９３－２８９７．
［２］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋ－ｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｔｏｘｉｎｓ２．ｈｔｍｌ．
［３］ＣｒｉｃｋｍｏｒｅＮＤ，ＺｅｉｇｌｅｒＲ，ＦｅｉｔｅｌｓｏｎＪ，ｅｔａｌ．Ｒｅｖｉ－ｓｉｏｎｏｆｔｈｅｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｆｏｒｔｈｅＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ\ue011ｓｉｓｐｅｓｔｉｃｉｄａｌｃｒｙｓｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｒｅｖｉｅｗｓ，１９９８，６２：８０７－８１３．
［４］ＴａｉｌｏｒＲＪ，ＴｉｐｐｅｔｔＧ，Ｇｉｂｂ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｅａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｎｓｉｓｄｅｌｔａ－ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｅｎｔｏｍｏｃｉｄａｌｔｏｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎａｎｄｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎｌａｒｖａｅ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２，６：１２１１－１２１７．
［５］ＣｈｏｉＳＫ，ＳｈｉｎＢＳ，ＫｏｎｇＥＭ，ｅｔａｌ．ＣｌｏｎｉｎｇｏｆａｎｅｗＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｃｒｙｌＩ－ｔｙｐｅＣｒｙｓｔａｌＰｒｏ－ｔｅｉｎｇｅｎｅ［Ｊ］．ＣｕｒｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００，４１：６５－６９．
［６］ＳｅｋａｒＶ，ＨｅｌｄＢ，ＴｉｐｐｅｔｔＪ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｆｒａｇ－ｍｅｎｔｏｆＣｒｙＶ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉ－ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，６３（７）：２７９８－２８０１．
［７］ＡｎｇａｍｕｔｈｕＳ，ＶａｎｇａＳＲ，ＫｕｍａｒＰＡ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｗｉｔｈａｎａｔｉｖｅｃｒｙ１Ｉａ５ｇｅｎｅｃｏｎｆｅｒｓｃｏｍｐｌｅｔｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＨｅｌｉｏｔｈｉｓａｒ－ｍｉｇｅｒａ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，１９９８，４：４７３－４７８．
［８］ＳｏｎｇＦＰ，ＺｈａｎｇＪ，ＧｕＡＸ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｒｙ１Ｉ－ｔｙｐｅｇｅｎｅｓｇｅｎｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｔｒａｉｎｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｃｒｙ１Ｉ－ｔｙｐｅｇｅｎｅ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，６９（９）：５２０７－５２１１．
［９］ＥｓｃｕｄｅｒｏＩＲ，ＥｓｔｅｌａＡ，ＰｏｒｃａｒＭ，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａＣｒｙ１ＩｐｒｏｔｅｉｎｔｏｘｉｃｔｏｉｎｓｅｃｔｓｏｆｔｈｅｆａｍｉｌｉｅｓＮｏｃｔｕｉｄａｅ，Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ，Ｐｌｕｔｅ－ｌｌｉｄａｅａｎｄＣｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎ－ｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，７２（７）：４７９６－４８０４．
［１０］ＤｉｅｇｏＨＳ，ＪｏｒｇｅＳ，ＡｌｅｊａｎｄｒａＢ，ｅｔａｌ．ＴｏｘｉｃｉｔｙｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ δ－ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓａｇａｉｎｓｔｂｅａｎｓｈｏｏｔｂｏｒｅｒ（ＥｐｉｎｏｔｉａａｐｏｒｅｍａＷａｌｓ．）ｌａｒｖａｅ，ａｍａ－ｊｏｒｓｏｙｂｅａｎｐｅｓｔｉｎＡｒｇｅｎｔｉｎａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｒ－ｔｅｂｒａｔｅＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２００７，９４：１２５－１２９．
［１１］ＫｏｓｔｉｃｈｋａＫ，ＷａｒｒｅｎＧＷ，ＭｕｌｌｉｎｓＭ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏ－ｎｉｎｇｏｆａｃｒｙＶ－ｔｙｐｅｉｎｓｅｃｔｉｅｉｄａｌｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｆｒｏｍＢａ－ｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｔｈｅｃｒｙＶ－ｅｎｅｏｄｅｄＰｒｏｔｅｉｎｉｓｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄｅａｒｌｙｉｎｓｔａｔｉｏｎａｒｙｐｈａｓｅ［Ｊ］．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９６，１７８：２１４１－２１４４．
［１２］宋福平，張杰，顧愛星，等．蘇云金芽胞桿菌ｃｒｙ１Ｉ基因沉默 的 研 究 ［Ｊ］．自 然 科 學 進 展，２００２（１２）：９３４－９３８．
［１３］ＴｏｕｎｓｉＳ，ＺｏｕａｒｉＮ，Ｊａｏｕａ．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｃｒｙ１Ｉａ－ｔｙｐｅｇｅｎｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐｋｕｒｓｔａｋｉ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，９５：２３－２８．
［１４］劉廷輝，郭巍，申建茹．蘇云金芽胞桿菌ＧＳ８菌株的生物學 特 性 及ｃｒｙ基 因 型 鑒 定 ［Ｊ］．農 藥 學 學 報，２００９，１１（１）：９２－９７．
［１５］ＳａｍｂｒｏｏｋＪ，ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＥＦ，ＭａｎｉａｔｉｓＴ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ［Ｍ］．２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，２００２．
［１６］宋福平，張杰，黃大昉，等．蘇云金芽胞桿菌ｃｒｙ基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ鑒定體系的建立［Ｊ］．中國農業科學，１９９８，３１（３）：１３－１８．
［１７］郭?。奂y夜蛾對蘇云金芽胞桿菌Ｃｒｙ１Ａｃ的抗性及其防御體系的研究［Ｄ］．廣州：中山大學，２００５．
［１８］ＺｈａｏＪＺ，ＣａｏＪ，ＬｉＹＸ，ｅｔａｌ．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｎｇＴｗｏＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＴｏｘｉｎｓＤｅｌａｙＩｎｓｅｃｔＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＥｖｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ－ｇｙ，２００３，２１（１２）：１４９３－１４９７．
［１９］張杰，宋福平，李長友，等．對鞘翅目害蟲高毒力Ｂｔ基因ｃｒｙ３Ａａ７的分離克隆及表達研究［Ｊ］．中國農業科學，２００２，３５（６）：６５０－６５３．
［２０］ＡｂｂｏｔｔＷＳ．ＡＭｅｔｈｏｄｏｆＣｏｍｐｕｔｉｎｇｔｈｅＥｆｆｅｃｔｉｖｅ－ｎｅｓｓｏｆａｎＩｎｓｅｃｔｃｉｄｅ［Ｊ］．ＪＥｃｏｎＥｎｔｏｍｏｌ，１９２５，１８：２６５－２６７．
［２１］宋福平．蘇云金芽孢桿菌ｃｒｙ１ｌｅ１和ｃｒｙ８基因的研究［Ｄ］．北京：中國農業科學院，２００３．
［２２］劉金環，薛靜，宋福平，等．蘇云金芽胞桿菌ＢｔＣ００８殺蟲晶體蛋白基因鑒定、克隆及殺蟲活性分析［Ｊ］．植物保護，２００６，３２（６）：２２－２６
