研究表明，當血管壁的完整性遭到破壞時，狹窄局部的血管壁切應力\\( wall shear stress，WSS\\) 過高導致與血流接觸的內膜損傷，可以誘發內皮細胞異常表達組織因子\\( tissue factor，TF\\)［1，2，3，4］。本研究應用套扎法建立大鼠頸總動脈狹窄模型，應用免疫組化和原位雜交法結合圖像分析，對血管狹窄后切應力誘導內皮細胞 TF 早期表達規律進行了初步在體研究。
1 材料與方法
1. 1 實驗動物與分組 SPF 級 SD 雄性大鼠 45 只，質量 320 ± 18. 5g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。隨機數字法分為對照組\\( C 組，n =5\\) 、狹窄組\\( S組，n =40\\) ，狹窄組分 0. 25、0. 5、1、2、4、8、16、24 h，8個時相點，每個時相點各 5 只大鼠。
1. 2 狹窄模型制作及標本采集 以 2. 5% 戊巴比妥鈉 40 mg/kg 體重腹腔注射麻醉，待靜臥后睫毛反射消失，仰位固定。無菌條件下，頸部備皮消毒后，頸部正中行長約 2. 5 cm 縱行切口，逐層分離，游離出左側頸總動脈中段長 8 ～ 10 mm，套入縱形剖開的內徑約0. 3 mm，長 3 mm 的硅膠管，外用 4 號絲線雙重扎緊，復位后縫皮。分別在術后 0. 25 h、0. 5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h，8 個時相點，使用 TS420 型多普勒血流儀，1. 5 prb 探頭，檢測狹窄下游 5 mm 內的每分平均血流量 Q，檢測時小心游離出頸總動脈外膜的疏松結締組織，保持探頭與血流方向垂直，每例檢測約5 ～ 10min，待顯示平穩時記錄數字，得到每分平均血流量Q。隨后在 Digitex 數字減影血管成像系統下，仰位固定，用自制導管\\( 直徑約 1. 5 mm\\) 刺入左心室，快速注射 1 ml 碘佛醇\\( 240 mg/ml\\) ，即時進行正位數字減影血管造影\\( Digital subtraction angiography，DSA\\) ，測量正常和狹窄血管內經 D，計算出狹窄程度。C 組只分離左頸總動脈，進行 Q 和 D 值的測量。隨后采用復合固定液\\( 4% 多聚甲醛，1‰DEPC，0. 1 mol/L PBS，pH7. 4\\) 約 30 ml 直接低壓灌注，0. 1 h 后取下狹窄段血管固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，常規石蠟包埋，切片厚度 6 μm。
1. 3 切應力計算 把測得在體血管內徑\\( D\\) 和每分平均血流量\\( Q\\) 代入 Poiseiulle 流體公式計量動脈平均壁切應力: Tw= 32ηQ / πD3\\( 血液黏稠度 η = 0. 035dynes. s / cm2. 5］\\) 。
1. 4 TF mＲNA 采用原位雜交法檢測 石蠟切片常規脫蠟至水并水化后，參照試劑盒說明，3% 檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶 37. 0 ℃消化 0. 5 h，預雜交液恒溫箱40. 0 ℃ 6 h，TF 寡核苷酸探針\\( MK3023，武漢博士德生物工程公司提供\\) ，雜交液恒溫箱內 42. 0 ℃雜交 8h，封閉液 37. 0 ℃ 孵育 0. 5 h，生物素化鼠抗地高辛37. 0 ℃ 孵育 1. 0 h，滴加 SABC 復合物 37. 0 ℃ 孵育0. 5 h，生物素化過氧化酶 37. 0 ℃ 孵育 0. 5 h，DAB 顯色\\( 試劑盒 AＲ1022，武漢博士德生物工程公司提供\\) 。按試劑盒提供的已知陽性片作為陽性對照，以 PBS 代替雜交液作為陰性對照。TF mＲNA 陽性結果為細胞漿出現棕黃色顆粒。
1. 5 TF 蛋白采用免疫組織化學染色檢測 石蠟切片脫蠟至水并水化，參照試劑盒說明，3% 過氧化氫室溫下孵育 0. 25 h，浸入 0. 01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液\\( pH6. 0\\) ，微波爐中火加熱至沸騰，反復 3 次，每次間隔0. 1 h，10% 羊血清 37. 0 ℃ 孵育 0. 25 h，分別加入一抗兔抗 TF 多克隆抗體\\( BA1714，武漢博士德生物工程公司提供，稀釋度 1∶120\\) ，4. 0 ℃冰箱放置 8 h，生物素標記的山羊抗兔 IgG 抗體\\( 二抗\\) 20. 0 ℃ 孵育 0. 5h，鏈霉菌抗生物蛋白-過氧化物酶溶液 20. 0 ℃ 孵育0. 5 h，DAB 顯色\\( 試劑盒 AＲ1022，武漢博士德生物工程公司提供\\) 。按試劑盒提供的已知陽性片作為陽性對照，以 PBS 代替雜交液作為陰性對照。TF 陽性結果為細胞胞漿著色，呈棕黃色。
1. 6 圖像分析 以細胞漿出現的棕色細顆粒為陽性染色，采用 Leica Qwin 病理圖像分析系統測定陽性表達物的平均灰度值\\( mean gray，MG\\) ，灰度值 0\\( 黑色，表達最強\\) ，255\\( 白色，無表達\\) 。每張切片測量前均用該片空白區校正并調節光亮度，以達到不同指標測量標準相同。本實驗各組切片空白區灰度值平均為245，每組抽取 5 張切片，在 630 × 光鏡下隨機選取 4個區域，測定內膜的 MG，以相對平均灰度值\\( ＲMG\\)表示，即陰性對照 MG 減去實驗 MG。
1. 7 統計學分析 數據以均數 ± 標準差\\( x ± s\\) 表示，SPSS 16. 0 統計軟件處理，組間均數比較用單因素方差分析，以 P ＜0. 05 確定有顯著性。
2 結 果
2. 1 血流量和切應力變化 DSA 測得靜息狀態下大鼠左頸動脈正常血管內徑為 1. 14 ±0. 05 mm，各組狹窄血管內徑為 0. 21 ±0. 02 mm，本模型的平均狹窄率為 82%。靜息狀態下大鼠左頸動脈狹窄前和狹窄后各時相血流量見表 1。對照組和狹窄組的血流量和切應力有顯著性差異\\( P ＜ 0. 01\\) ，狹窄后各組間血流量和切應力無顯著性差異\\( P ＞0. 05\\) 。
2. 2 TF mＲNA 轉錄和蛋白的表達變化 正常對照組頸總動脈內膜內皮細胞的 TF mＲNA 和蛋白有微量表達，狹窄 0. 25 h 后，檢測到頸動脈內膜內皮細胞表達的 TF mＲNA 和蛋白增強\\( P ＜ 0. 01\\) ，主要存在于胞漿，隨著狹窄時間的延長，陽性細胞數及著色程度逐漸增加，狹窄后4 h 達到峰值\\( P ＜0. 01，表2\\) ，以后逐漸下降，但各時相點與正常組相比均顯著升高\\( P ＜0. 01\\) ，狹窄后 24 h，相對平均灰度值仍然高于對照組\\( P ＜0. 01，表 2\\) 。
3 討 論
血液動力學作用在新生血管形成、血管壁結構重建以及動脈粥樣硬化的發生發展中起著肯定性的作用［6］。血流作用于動脈的力可以分解成兩個主要的向量［7，8］: 一是垂直于管壁的代表壓力的向量，二是作用于內皮細胞表面與管壁平行因血液的沾滯性而產生的摩擦力，即 WSS。血管壁的所有成份\\( 內皮細胞、平滑肌細胞、細胞外基質等\\) 都承受脈動壓力產生的伸張，但內皮細胞表面所承受的力以 WSS 為主［［9，10］。
硅膠管套扎大鼠頸總動脈中段造成的狹窄不損傷血管內膜［11］，大鼠左頸內動脈的近心段長直均勻且無分支，可以應用 Poiseiulle 流體公式計量平均WSS［5］。運用數字減影血管造影和多普勒血流儀能精確地測量在體血管內徑和每分平均血流量，計算出準確的狹窄程度和切應力。本模型造成的狹窄達到重度，局部切應力比狹窄前增強了 3. 8 倍，15 min 后TF 的 mＲNA 轉錄和蛋白開始表達，證實了局部的切應力過高導致血管內膜損傷，是誘發內皮細胞異常表達組織因子，導致血栓形成和斑塊產生［5，12，13］。
體外研究表明，內皮細胞 TF mＲNA 和蛋白在基礎狀態下幾乎檢測不到，給予切應力誘導后表達上調，說明 TF 基因上調的誘發與內皮細胞的切應力變化有關［14，15］。本實驗在大鼠頸總動脈狹窄段的高切應力區觀察到內膜的 TF 的 mＲNA 轉錄和蛋白表達均明顯增強，約 4 h 達到峰值，說明只要血管局部狹窄，造成血流紊亂，切應力發生了改變，就可以早期誘導TF 基因表達。體外實驗研究表明，這可能主要與即早基因家族\\( immediate early genes，IEGs\\) 的 Egr-1 和Sp1 有關［15］，轉錄因子核因子 κppa-B\\( NF-κB\\) 和活化蛋白-1\\( AP-1\\) 活化后也可以參與其上調［16］。多種因素使內皮細胞 TF 基因表達上調，血管損傷后，在多種炎性因子如白介素-1\\( IL-1\\) 、脂多糖\\( LPS\\) 、腫瘤壞死因子-α\\( TNF-α\\) 、干擾素\\( INF\\) 、內皮細胞黏附分子-1\\( ICAM-1\\) 、前列環素\\( PGI2\\) 等作用下，血管內皮細胞TF 基因表達也可以增強［17-20］。
參考文獻
［1］ KAWAHAＲA D，MATSUDA T. Hydrodynamic shear-stress-dependent retention of endothelial and endothelial progenitorcells adhered to vascular endothelial growth factor-fixed sur-faces［J］. Biomed Mater Ｒes B Appl Biomater. 2012，100\\( 5\\) : 1218-1228.
［2］ DELA PAZ NG，WALSHE TE，LEACH LL，et al. Ｒole ofshear-stress-induced VEGF expression in endothelial cellsurvival［J］. Cell Sci，2012，15; 125\\( 4\\) : 831-843.
［3］ MAZZOLAI L，SILACCI P，BOUZOUＲENE K，et al. Tissuefactor activity is upregulated in human endothelial cells ex-posed to oscillatory shear stress ［J］. Thromb Haemost，2002，87\\( 6\\) : 1062-1068.
［4］ GＲABOWSKI EF，ＲEININGEＲ AJ，PETTEＲUTI PG，et al．Shear stress decreases endothelial cell tissue factor activityby augmenting secretion of tissue factor pathway inhibitor［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21\\( 1\\) : 157-162.
