自噬\\( autophagy\\) 是真核細胞利用溶酶體降解損傷的長壽蛋白及細胞器的過程，通過對細胞降解成分的再利用在維持內環境穩態中起著非常重要的作用。

正常生理情況下，它維持在較低的水平，清除多余、受損的細胞器，為細胞提供保護作用。在病理情況下，氧化應激、肝細胞營養缺乏、缺血再灌注損傷、肝臟衰竭都能引起自噬，是一種細胞對不利因素的適應性反應。

近年來國內外各項研究顯示，自噬參與肝臟疾病的多個領域，尤其與缺血再灌注損傷過程關系十分密切，現就近年來關于自噬與肝臟缺血再灌注損傷相關作用和機制的研究進展作一概述。

1 細胞自噬

1． 1 概述

自噬現象最早是由 Ashford 和 Porter于1962 年用電子超微顯微鏡觀察人體肝細胞時發現，是細胞內的一種重要代謝過程。細胞的部分細胞質與細胞器被從粗面內質網的無核糖體附著區脫落的雙層膜或多層膜包裹形成自噬體\\( autophagosome\\) 后與溶酶體整合形成自噬溶酶體，被其分解為核苷酸、氨基酸、游離脂肪酸等小分子供細胞本身的代謝和能量的利用。

1． 2 分類

根據生理過程和細胞內底物轉運溶酶體方式的不同，可將哺乳動物的自噬現象分為 3 種: \\( 1\\)大自噬\\( macroautophagy\\) : 細胞漿中可溶性蛋白質和壞死的細胞器被非溶酶體來源的雙層膜包裹形成自噬小泡，與溶酶體融合后形成氨基酸等被再利用的過程，目前以大自噬的研究為主。\\( 2\\) 小自噬\\( microautoph-agy\\) : 小自噬直接利用溶酶體包裹吞噬并降解胞漿中的長壽蛋白。\\( 3\\) 分子伴侶介導的自噬\\( chaperon me-diated augophagy，CMA\\) : 胞質內蛋白分子的氨基酸序列結合到分子伴侶 Hsc73，之后被轉運到溶酶體腔中被水解酶分解供細胞再利用。CMA 的底物是可溶的蛋白分子，可選擇性清除蛋白質，而其余兩種自噬現象無明顯的選擇性。因此，自噬被認為是真核細胞中存在最廣泛的降解 － 再循環系統。

1． 3 分子機制

目前參與自噬的基因有上百種，被統一命名為自噬相關基因\\( autophagy associated gene，Atg\\) 。一條修飾過程是 Atg12 首先被 IE 樣酶 Atg7 活化后轉運至 Atg10，然后與 Atg5 結合形成自噬體前體，最后此復合物與 Atg16 結合形成 Atg5-Atg12-Atg16L復合物，此過程促進了自噬泡的伸張，使之由小泡樣的結構發展為環狀結構。同時，Atg5-Atg12-Atg16L 復合物也促進了微管相關蛋白 1 輕鏈 3\\( LC3\\) 向自噬泡的聚集，而 LC3 修飾是自噬泡的形成過程的必要組成部分。第二條為泛素樣蛋白加工修飾過程。此過程參與LC3 的形成，LC3 被 Atg4 分解生成 LC3-Ⅰ，同時 LC3-Ⅰ也被 E1 樣酶 Atg7 活化，轉運至 Atg3，生成自噬體的標志分子 － LC3-Ⅱ。如果自噬體與溶酶體融合，自噬體內的 LC3-Ⅱ立即被溶酶體中的水解酶降解。哺乳動物細胞中內源性 Atg5 和 Atg12 主要以結合的形式存在，而胞漿可溶性 LC3-Ⅰ和膜結合型 LC3-Ⅱ之間的比例在不同組織和細胞類型變化巨大。哺乳動物細胞自噬進程中兩條泛素樣加工的修飾過程可以互相調節，互相影響\\( 見圖 1\\) 。

1． 4 發生發展

自噬現象的發生過程以大自噬為例可分為 4 個部分: \\( 1\\) 自噬的誘導。在正常條件下，細胞自噬一般在體內以低水平進行用以維持內部環境的平衡穩態，當細胞受到細胞器的損壞、突變蛋白的累聚及微生物的侵襲以及饑餓、營養缺乏等外部應激時，其自噬活性迅速升高。靶向雷帕霉素蛋白\\( target of ra-pamycin，TOR\\) 激酶便可使自噬在細胞生長因子存在和營養豐富情況下關閉，感受細胞氨基酸、ATP 和激素的變化，是調控細胞自噬過程的關鍵點。哺乳動物靶向雷 帕 霉 素 蛋 白 \\( mammalian target of rapamycin，mTOR\\) 同樣以一種類似酵母菌的機制調控自噬過程。

除此之外，Ras 信號通路也可通過生長因子調控自噬，可將信號從生長因子酪氨酸激酶傳遞到細胞內的效應器，如 Raf/促分裂素原活化蛋白激酶\\( mitogen-activa-ted protein kinases，MAPK \\) 和磷脂酰肌醇 3 激酶 1\\( phosphatidylinositol 3-kinase 1，PI3K-1\\) 。\\( 2\\) 自噬體的形成。隨著分隔膜不斷延伸，將被降解的胞漿成分完全隔離形成自噬體。\\( 3\\) 自噬體的運輸、融合。自噬體通過細胞骨架微管網絡系統將細胞降解成分傳送至溶酶體中。\\( 4\\) 內容物的降解利用。隨著人們對自噬發生過程研究的深入，新的相關環節不斷發現，對醫學進步進程的推動起到了巨大作用，但仍有許多重要調控機制及模型有待進一步探究。

1． 5 檢測方法

目前自噬常用的檢測方法大致可分為形態學方法、免疫染色方法以及分子生物學方法。

利用電鏡觀查到膜狀結構的自噬小體屬于形態學方法，是最主要最直接的證據，是自噬檢測的金標準。免疫染色法可將 LC3-Ⅰ\\( 微管相關蛋白1 輕鏈3\\) 經泛素樣加工修飾，與磷脂酰乙醇結合形成 LC3-Ⅱ，通過LC3 組成成分的含量和比例表明自噬發生的數量和程度。近年來，綠色熒光蛋白\\( GFP\\) 與 LC3 結合的質粒已廣泛用于研究自噬。

2 肝臟缺血再灌注與自噬

2． 1 肝臟缺血再灌注中的自噬現象

通常情況下，機體通過良好的血液循環維持機體的正常代謝及功能。

而充血性心力衰竭、休克、肝外傷及心臟手術經常導致心源性及血容量性休克，引起嚴重低血壓和低氧血癥進而導致肝臟缺血。在對自噬特異性標志物 LC3-Ⅱ的檢測中發現，一定條件下的血液再灌注后，部分細胞結構破壞以及功能代謝障礙加重伴隨著自噬活性的升高，這對缺血再灌注損傷時肝細胞功能作用的探究具有重大意義。

Sybers 等早在 30 年前便首次觀察到體外培養的小鼠在類似缺血再灌注的處理后，含有壞死細胞器的自噬泡不斷增加。Decker 等也通過兔心模型驗證了單純的缺血現象即可以誘導心肌自噬，而再灌注過程可以強化自噬，同時在另一實驗中發現缺血超過1 h 的狀態下，無功能性自噬泡數量增加，這為我們進行肝缺血再灌注過程中自噬的研究提供了良好的前提。近期臨床實驗表明，在人造缺血再灌注條件下，多例患者的治療效果均有所提高，表明自噬水平的增加可以抑制肝臟細胞的死亡，但自噬對肝缺血再灌注損傷到底起保護還是損傷作用仍存在較大的爭議，現在的主要研究都集中在其信號傳導與機制方面。如P53、P62、GSK3β、血紅素加氧酶 1\\( HO-1\\) 等都對肝臟缺血再灌注中的自噬起到重要作用。

2． 2 誘發及調節機制

研究精確的自噬信號轉換機制對研究自噬對肝功能恢復的意義至關重要。自噬與其他生物體存在的生理過程一樣，都受到細胞以及細胞內成分的調控用以維持機體的穩態平衡，目前作為此機制的中心分子 TOR 是控制細胞自噬的關鍵點，它感受細胞成分與信號的變化，改變自噬的發生發展水平，如能量、酸堿平衡以及 PI3K-1、MAPK 及 p53 等基因蛋白的水平，都可以通過此途徑調節自噬的變化過程\\( 見圖 2\\) 。

2． 2． 1 依賴 mTOR 途徑: TOR 是一個絲氨酸 / 蘇氨酸激酶，調控細胞的周期和生長等。在哺乳動物中，處于活化狀態的 TOR 同源物 mTOR 通過磷酸化抑制自噬過程的起始分子 ULK 的功能，從而抑制自噬發生。

TOR 可以生成復合體，包括 mTOR、GβL\\( 也稱為類 G蛋白 β 亞基蛋白\\) 和 Raptor 等，信號傳導分子 Rash 和PI3K-1 可通過磷酸化 Akt\\( 蛋白激酶 B\\) 、ERK1 /2 和PKC\\( 蛋白激酶 C\\) 傳遞信號到小 GTP 酶從而使 mTOR活性增強，抑制自噬發生。

2． 2． 2 不依賴 mTOR 途徑: 其關鍵分子是 PI3K-Ⅲ /hVps34。同源體 Beclin-1 和抑癌基因 UVRAG作為自噬的正調控因子，抗凋亡因子 Bcl-2 負性調控自噬，共同參與組成復合物調控自噬發生。

2． 2． 3 AMPK 途徑: AMPK 在自噬的發生中也發揮著極其重要的作用，作為細胞中感受能量狀態調節代謝的一個蛋白激酶，在低 ATP 水平狀態下\\( 如饑餓或缺氧\\) ，AMPK 感受能量的變化，可通過磷酸化 TSC2，抑制 mTOR 活性，誘導細胞發生自噬。與此同時也有研究表明，此途徑可以直接促進 ULK 誘導自噬發生。

2． 3 自噬對肝臟缺血再灌注的作用

細胞的程序性死亡對細胞存活具有非常重要的意義，Kohli 等以及國內通過建立大鼠肝臟缺血再灌注模型研究表明，再灌注損傷過程中發生肝細胞凋亡，且隨缺血時間延長而加強，從而推斷凋亡可促使凋亡分子及其誘導分子釋放，使肝臟細胞死亡。但 Gujral 等發現通過抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶并不能有效地保護肝功能，這就說明另一種細胞死亡機制 － 自噬在保護過程中發揮重要作用。目前，對心臟缺血再灌注中自噬的功能作用研究已相對比較成熟，但對肝臟還有很大的研究空間，肝細胞缺血與心肌缺血本質上相同，因此，自噬可以被急性和慢性缺血誘導在再灌注過程會促進自噬體的形成。但缺血過程中的自噬對肝臟起保護作用還是損傷作用，目前尚存在較大爭議。

LC3 是自噬體的特異性標記蛋白，通過缺血再灌注后 LC3 的表達水平可即時反映自噬情況變化，國內研究顯示在缺血再灌注 30 min 后有自噬體的產生，而在 3 h 后達到最高峰，隨后在 24 h 細胞自噬水平不斷降低。結合 AST、ALT 對細胞功能的檢測，可以認為自噬對肝臟缺血再灌注損傷起某種程度的保護性反應。在肝臟缺血再灌注損傷中，自噬的出現與組織血供情況、刺激強度作用有關，缺血時間短，傷害刺激較弱均可刺激自噬激活，在一定程度上減少細胞凋亡，保護肝功能。而這種關系被 Hamacher-Brady 等驗證凋亡與自噬是通過線粒體通透性轉換\\( mitochondrialpermeability transition，MPT\\) 而實現的。短時間、少量營養物質缺乏導致部分線粒體通透性增加，自噬水平增強，產生負反饋抑制溶酶體降解肝細胞，而大量線粒體發生 MPT 時，由于 ATP 水解過多，發生大量氧化磷酸化脫耦聯，細胞就表現為凋亡、壞死從而引起肝細胞損傷，凋亡與自噬平衡點是眾多學者研究的關鍵。而在此平衡點內采取干預措施控制自噬的水平能減少肝細胞的進一步損傷需要更加深入細致的探究。

體外培養 HepG2 細胞，通過三氣培養箱對細胞進行缺血缺氧再灌注的處理，并在吖啶橙染色熒光顯微鏡定性觀察細胞質內出現紅色的點狀及斑點狀結構為自噬特征性結構 － 自噬泡，這說明細胞缺血后細胞內自噬水平迅速提高。再灌注恢復其氧供后 LC3的變化隨時間不同而變化，伴隨 AST/ALT 酶學檢測肝細胞也發生變化。

2． 4 自噬相關因子研究進展

目前，國內外多項研究表明，各種酶學及基因對自噬的調節功能各不相同，從酶學角度上說，HO-1 \\( 血紅素加氧酶 1\\)可通過PI3K 途徑提高自噬的發生水平從而減輕肝臟缺血再灌注損傷。而 3-甲基腺嘌呤\\( 3-MA\\)是通過抑制磷脂酰肌醇激酶降低 ATP 水平，特異性阻斷細胞中自噬發生，干擾肝功能恢復。靶蛋白 GSK-3β 被 PKB 磷酸化后失活，穩轉 GSK-3βKD細胞自噬水平高于未轉錄的細胞。

從基因水平上來說，P53 參與自噬過程的調節，一方面通過活化激活 AMPK，負性調節 mTOR，另一方面通過上調 mTOR 抑制因子或其靶蛋白 DRAM 負性調節 mTOR，從而誘導發生，但 Tasdemir 等通過實驗利用 P53 抑制劑 PTF-α 抑制 P53 的活性或用 siRNA沉默 P53，均可導致細胞自噬作用增強，表明 P53 可負性調節自噬，其機制可能與其含量、應激水平或者應激信號有關。最新研究發現 P53 參與自噬調節，其中包括轉錄非依賴途徑和轉錄依賴途徑: 轉錄非依賴途徑是通過 P53 的活化激活 AMPK，負性調節 mTOR，而轉錄依賴途徑可通過上調 mTOR 抑制因子 PTEN 和基因TSC1，或是 P53 調節的自噬和細胞死亡基因 DRAM 負性調節 mTOR，從而誘導自噬發生。

3 總結與展望

自噬與疾病關系的研究已經成為此領域一個新的熱點。目前，對于自噬在肝臟缺血再灌注過程中發揮的作用還沒有明確的結論，在正常肝缺血的早期，自噬可能發揮對細胞的保護作用，應以此為依據，通過加強藥物干預和效果監測調動自噬在恢復肝細胞功能中的保護作用，相反在疾病發展的中晚期，由于其與細胞凋亡的串擾以及負反饋調節的失衡，自噬對肝細胞起損傷作用。在不同疾病中，自噬也發揮相區別的作用，肝癌中自噬誘導細胞程序性死亡而抑制其保護作用。

因此，提高肝缺血再灌注治療中自噬的水平，探尋其發展、調節因素和調節通路，掌握自噬與其凋亡等生理過程的相互關系，有助于我們發現新的治療肝病的策略。例如，作為組織中對缺血、缺氧最敏感的內皮細胞在自噬條件下生理狀態如何變化，P53 的雙層作用以及與調控有關的各因子的影響因素，對于這些機制更加深入的認識，終將為人類對抗和最終解決這些疾病問題產生深遠影響。