ＭＴ０１是模擬人類線粒體ＤＮＡ設計的單鏈寡脫氧核苷酸（ｏｌｉｇｏｄｅｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＯＤＮ）序列，含有２７個堿基，其富含胞嘧啶Ｃ，每９個堿基序列中含有５個連續的堿基Ｃ。２００９年Ｙａｎｇ等證實ＭＴ０１具有強免疫活性，并指出ＭＴ０１有潛力作為一種新型的免疫抑制性ＯＤＮ來治療Ｔｏｌｌ樣受體（ＴＬＲ）激活相關的疾病。本課題組前期研究［２］顯示：ＭＴ０１能夠誘導成骨細胞分化并增殖，促進成骨細胞表達成骨相關因子；體外實驗觀 察 到ＭＴ０１能夠以胞吞作用進入ＭＧ６３成骨樣細胞系。
以往國內外對ＯＤＮ的實驗研究多采用靜脈、皮下或腹膜下注射等方式，而本課題組前期體內實驗研究均采用牙齦黏膜下局部注射ＭＴ０１的方式，在大鼠正畸牙移動實驗中觀察到ＭＴ０１能夠減少壓力側牙槽骨表面破骨細胞的數量，增加牙周膜中Ⅰ型膠原的表達水平，減少核因子κＢ受體活化因子配體 （ｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖａｔｏｒｆｏｒｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－κＢｌｉｇａｎｄ，ＲＡＮＫＬ）的表達水平；此外ＭＴ０１能夠顯著減少牙周炎大鼠牙槽骨的吸收水平。鑒于目前采用牙齦黏膜下局部注射的研究少有報道，本研究采用牙齦黏膜局部注射后，觀察ＭＴ０１進入大鼠主要臟器組織及其在各組織中的分布規律，為進一步研究開發ＭＴ０１在牙周局部應用奠定實驗基礎。
１材料與方法
１．１實驗動物、主要試劑和儀器６０只 Ｗｉｓｔａｒ大鼠購自吉林大學實驗動物中心，動物許可證號：ＳＣＸＫ（吉 ）２００８－０００５；ＯＤＮＭＴ０１， 序 列５′－ＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＣＣＴＣＴ－３′，由吉林大學 基礎醫學院分子生物學教研室自主設計，生工生物工程上海股份有限公司合成，全硫代修飾，５′端標記Ｃｙ５；速眠新購自吉林省華牧動物保健品有限公司；激光共聚 焦顯微鏡 （ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ８１，日本），快速冰凍切片機 （ＬＥＩＣＡＣＭ１８５０公司，德國），Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（碧云天，中國），賴氨酸附膜載玻片（武漢博士德公司，中國），蓋玻片、ＯｌｙｍｐｕｓＦＶ１０－ＡＳＷ１．７ Ｖｉｅｗｅｒ軟 件 和ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ２００３軟件。
１．２實驗動物分組ＳＰＦ級健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠６０只，體 質 量 為 （２００±１０）ｇ，隨 機 分 為 注 射ＭＴ０１的對照組和注射Ｃｙ５標記ＭＴ０１的實驗組，每組３０只。然后按時間點隨機分為１５ｍｉｎ、１ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄ和５ｄ組，每組３只。
１．３注射方式和注射劑量各組大鼠均適應性喂養１周。乙醚淺麻后，實驗組、對照組大鼠于右側上頜第一恒磨牙頰側牙齦黏膜下分別注射Ｃｙ５標記和 未 熒 光 標 記 的ＭＴ０１２μｇ（２０ ｍｇ·Ｌ－１，０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢＳ稀釋），分別于注射后１５ｍｉｎ、１ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ、１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄ和５ｄ在全麻下取實驗組大鼠肺、肝、脾、腎、心和腦組織。
１．４快速冰凍切片的制備和觀察各組織修塊，快速冰凍切片機切片， 每個組織３張， 厚度１０μｍ。 室溫下干 燥， 甲 醛 固 定１５ ｍｉｎ，０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢＳ沖 洗，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色３～５ｍｉｎ，０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢＳ沖洗，９０％甘油封片，４℃避光保存。激光共聚焦顯微鏡觀察各組織切片并拍照，每張切片隨機?。硰垐D像。形態學觀察ＭＴ０１在各臟器組織中的分布狀況，以熒光陽性細胞率表示ＭＴ０１進入各組織細胞量。熒光陽性細胞率＝單個計數區域內熒光陽性細胞數／區域內總細胞數。計數方法：每張圖像平均分為９個區域，隨機選擇３個區域計數，取平均值作為圖像的熒光陽性細胞率。
１．５統計學分析每組選擇３張圖像，應用ＦＶＶｉｅｗｅｒ１．７軟件對圖像計數，選擇３名非實驗相關人 員 分 別 計 數。 應 用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ２００３軟件計算各組織熒光陽性細胞率并以ｘ±ｓ表示。
２結果
２．１形態學觀察熒光陽性細胞的細胞核表現為藍色熒光，胞質表現為紅色熒光。對照組未觀察到熒光陽性細胞；實驗組大鼠肺、肝、脾和腎組織細胞中均能觀察到Ｃｙ５標記ＭＴ０１的熒光分布（圖１Ａ～Ｄ，見插頁三）；心、腦組織細胞中未見明顯的熒光分布（圖１Ｅ和Ｆ，見插頁三）。腎組織中熒光陽性細胞呈片狀分布，熒光主要集中于腎小管上皮細胞的胞質中，肺、肝、脾組織中僅見少量散在分布的熒光陽性細胞。
２．２實驗組各臟器組織中熒光陽性細胞率ＭＴ０１較早進入脾組織中，進入肺、腎和肝組織相對較晚。肝、脾和腎組織中的熒光陽性細胞率分別在注射ＭＴ０１３、１和２ｄ后呈先增高后降低的趨勢，峰值分別出現在注射后４、３和４ｄ；肺組織的熒光陽性細胞率隨時間變化無明顯規律性。腎組織的熒光陽性細胞率最大，肺、肝和脾組織的熒光陽性細胞率相對較小。見表１.
３討論
本課題組前期體內實驗觀察到ＭＴ０１具有顯著促進大鼠牙周組織成骨的作用，提示ＭＴ０１有可能作為一種新型的促牙槽骨組織再生的生物制劑應用于口腔臨床，因此了解ＭＴ０１在牙周組織中與非目標組織中的相對積聚量、代謝和清除特點、清除率及毒性等有重要意義。
目前已有大量實驗采用靜脈、皮下及腹膜下注射等方式研究ＯＤＮ的代謝及生物分布，但鮮有文獻報道口腔黏膜局部注射后ＯＤＮ的代謝及生物分布情況?？谇火つぞ植拷o藥具有避免肝臟首過效應、藥物利用率高、不良反應輕、致敏性小和組織修復快等優點，是口腔臨床用藥過程中較為常見的途徑。本實驗應用前期體內實驗中牙齦黏膜的注射方式，觀察到一定量的ＭＴ０１能夠隨血液循環進入大鼠的肺、肝、脾和腎組織中，且大鼠吸收ＭＴ０１后分布到各臟器組織存在著時間的差異性。
關于ＭＴ０１在大鼠體內主要臟器中的分布特點，目前許多研究表明：ＯＤＮ在大鼠各臟器組織中的分布存在差異性，且分布特征又具有一定相似性。
ＯＤＮ在腎、肝、脾組織中分布量較多，而在肺、腦、心的分布量較少。本實驗中腎臟組織的熒光陽性細胞率明顯高于其他臟器組織，熒光主要集中于腎小管上皮細胞內，腎小球未見明顯的熒光分布，表明腎臟可能是ＭＴ０１的主要代謝器官。
Ｌｅｎｄｖａｉ等采用６８Ｇａ標記ＰＳ－ＯＤＮ經大鼠尾靜脈注射后，觀察到放射線最強處集中在腎臟的皮質區。也有研究報道：經小鼠尾靜脈注射ＦＩＴＣ標記、硫代磷酸化修飾的反義寡核苷酸后，腎臟可見大量熒光沉積，肝、脾和肺僅見少量散在、細小的熒光分布，這與本實驗研究結果一致。
Ｈｊｅｌｓｔｕｅｎ等研究表明：尿液及膀胱中的ＯＤＮ水平較高，認為尿液是ＯＤＮ的主要排泄途徑。另有研究［９－１０］顯示：肝臟也是ＯＤＮ主要分布的臟器之一。 李東良等研 究 表 明： 小 鼠 靜 脈 注 射３Ｈ－ｃ－ＭｙｃＡＳ－ＰＳ－ＯＤＮ０．５ｈ后，肝、脾和肺中均觀察到較高濃度３Ｈ－ｃ－ＭｙｃＡＳ－ＰＳ－ＯＤＮ分布，與本實驗結果不同。關于不同ＯＤＮ體內分布差異性的影響因素，目前尚無定論。
Ａｍａｎｔａｎａ等認為：與ＰＳ－ＯＤＮｓ相似，二胺嗎啉代寡核苷酸（ＰＭＯｓ）的分布模式不依賴于本身的序列、長度及給藥方式，而ＰＭＯｓ的清除卻與時間和組織有關，還指出給藥途徑，如靜脈注射、口服、腹膜下注射、皮下注射 或 經 皮 膚、經 肺 給 藥，均 得 到 了 相 似 的ＰＭＯｓ代謝特征。
李東良等指出：靜脈注射反義硫代磷酸寡脫氧核苷酸后，其在親脂性器官中分布少，如腦和生殖器等。本實驗在腦組織中未觀察到熒光分布，其可能與血腦屏障有關。血腦屏障是介于血液和腦組織之間的屏障結構，主要的形態學基礎是緊密連接的毛細血管內皮細胞，其對血液中的物質具有高度的選擇透過性，只允許親脂性和相對分子質量小于６００的分子通過。磷酸二酯和硫代磷酸寡脫氧核苷酸為５～１０ｋＤａ的多聚陰離子分子，不能夠通過血腦屏障。本實驗中ＭＴ０１的相對分子質量為８３２５．６３，以０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢＳ緩沖液稀釋。推測ＭＴ０１的相對分子質量和親水性是影響其進入腦組織的可能因素。
ＯＤＮ與細胞組分的非專一性結合及其降解產物是導致ＯＤＮ毒性的２個主要方面。目前研究認 為： 適 當 濃 度ＯＤＮ是 低 毒 性 的。Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ等認為：低 劑 量ＰＳ－ＯＤＮ無 毒 性，但口服給藥是危險的，長時間應用較高劑量ＰＳ－ＯＤＮ可能導致腎臟損傷。
Ｈａｎａｇａｔａ也指出硫代磷酸化ＯＤＮ能引起腎臟損傷。劉紅等認為：雖然ＰＳ－ＯＤＮ是低毒性的，但其抑制細胞分化，在許多細胞系中，使用較高的非治療濃度充當細胞靜止劑。本實驗觀察到ＭＴ０１在腎臟組織中的分布量大于其他組織，且ＭＴ０１能夠抑制由ＣｐＧＯＤＮ等免疫刺激因素誘導的免疫反應，這就有必要了解ＭＴ０１的毒理性。牙齦黏膜局部注射ＭＴ０１后對大鼠正常臟器組織，尤其是腎臟組織是否有影響還有待今后的深入研究。
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