廣東涼茶是嶺南人民根據本地氣候、水土特性，研制總結出的一類具有清熱解毒、生津止渴等功效的植物飲料。癍痧涼茶是一種著名的廣東涼茶，具有清熱解毒、祛濕除癍、消暑散熱、化痰止咳、開胃消滯等獨特療效，現市場上銷售的癍痧涼茶有 “黃振龍”和 “平安堂”兩種品牌。由于癍痧涼茶是采用多味中藥熬制而成的復方制劑，成分復雜，涵蓋了不同極性、多個種類的化合物，分析和鑒定其中的化學成分成為該產品質量控制以及闡明其作用機理的關鍵。
指紋圖譜是評價中藥和中藥制劑整體質量的有效手段。中國和美國國家食品藥品監督局、德國藥用植物學會、英國草藥典、印度草藥典和加拿大藥用及芳香植物學會等機構均將指紋圖譜作為質量控制標準的內容之一。高效液相色譜\\( HPLC\\) 紫外檢測\\( UV\\) /二極管陣列檢測\\( DAD\\) 是目前最為成熟的指紋圖譜分析方法。然而，中藥含有很多無共軛體系的化合物，因其沒有紫外吸收或紫外吸收很弱而在 HPLC － UV/DAD 指紋圖譜上無法表現出來，從而造成指紋圖譜信息的不完全。這一不足可以通過高效液相色譜 － 質譜聯用\\( HPLC － MS\\) 得以克服。HPLC － MS 因具有比 HPLC － UV/DAD更好的化合物分析和鑒定能力而應用于中藥分析研究，在中藥指紋圖譜分析方面更具優勢。本文以“黃振龍”和 “平安堂”癍痧涼茶為研究對象，采用高效液相色譜 － 飛行時間質譜法\\( HPLC － TOF －MS\\) 和高效液相色譜 － 離子阱質譜法\\( HPLC － IT － MS\\) 對其所含化學成分進行分析，同時采用 HPLC －IT － MS 建立了癍痧涼茶的液質聯用指紋圖譜，并采用主成分分析對 41 批次的癍痧涼茶的質量穩定性和一致性進行了評價。
1 實驗部分
1. 1 儀器與試劑
1200 高效液相色譜儀配備二元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱，TOF － MS 飛行時間質譜儀，Trap XCT 離子阱質譜儀，Poroshell 120 SB － C18快速分離型高效液相色譜柱\\( 150 mm ×2. 1 mm，2. 7 μm\\) 購于美國 Agilent 公司。甲醇、乙腈\\( 色譜純，美國 Sigma 公司\\) ; 甲酸和乙醇\\( 分析純，廣州化學試劑廠\\) ; 實驗用水為超純水設備\\( 美國 Millipore 公司\\) 制備的超純水。
對照品: 葡萄糖酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸均購自美國 Sigma － Aldrich 公司; 沒食子酸購自中國藥品生物制品檢定所; 綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸 A、異綠原酸 B、異綠原酸 C、木犀草苷、黃芩苷購自四川成都普思生物科技有限公司。所有對照品的純度均大于 98%。21 批 “黃振龍” \\( HZL\\) 癍痧涼茶樣品和 20 批 “平安堂” \\( PAT\\) 癍痧涼茶樣品分別購自廣州黃振龍涼茶連鎖店和平安堂涼茶連鎖店。
1. 2 對照品溶液的制備
準確稱取對照品各 5. 0 mg 置于 50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為單一對照品溶液。分別精密吸取各單一對照品溶液 2. 0 mL 至50 mL 容量瓶中，甲醇稀釋定容，得到4 mg/L 混合對照品溶液。
1. 3 樣品分析
“黃振龍”和 “平安堂”癍痧涼茶樣品過 0. 45 μm 微孔濾膜后，分別采用 1200HPLC － MS TrapXCT 和 1200HPLC － TOF － MS 進行分析。色譜柱: Agilent Poroshell 120 SB － C18\\( 150 mm ×2. 1 mm，2. 7μm\\) ; 流動相 A 為 0. 5% 甲酸，B 為乙腈，梯度洗脫: 0 ～1 min，0% B，1 ～ 40 min，0 ～ 45% B; 40 ～60 min，45%～ 95% B; 后運行 10 min，0% B。流速 0. 3 mL / min; 進樣量為 1. 0 μL，柱溫為 35 ℃ 。
離子阱質譜分析: 電噴霧\\( ESI\\) 離子源，正、負離子掃描模式; 霧化氣\\( N2\\) 壓力 345 kPa，干燥氣\\( N2\\) 流速10 L/min，干燥氣溫度350 ℃; 毛細管電壓4 000 V。掃描質量范圍 m/z 50 ～1 500。Auto MS3模式，自動尋找豐度最高的 3 個離子進行二級和三級質譜分析。
飛行時間質譜分析: ESI 離子源，負離子模式檢測; 霧化氣\\( N2\\) 壓力 345 kPa，干燥氣\\( N2\\) 流速10 L / min，干燥氣溫度 350 ℃ ; 毛細管電壓 4 000 V，碎裂電壓 100 V，錐孔電壓 65 V; 掃描質量范圍m / z 50 ～ 1 500，Profile 模式記錄，高分辨測試參比離子 m / z 112. 9856、1 033. 988 1。
2 結果與討論
2. 1 儀器條件的優化
2. 1. 1 色譜條件的優化 考察了不同比例的甲醇 － 水、乙腈 － 水、甲醇 － 0. 5% 甲酸水溶液和乙腈 －0. 5% 甲酸水溶液為流動相時各化合物的分離效果，結果發現有機相為乙腈時的洗脫效果優于甲醇，各色譜峰分離效果更為理想。而 0. 5%甲酸的加入可以有效改善有機酸成分色譜峰的拖尾現象，因此實驗采用乙腈 －0. 5%甲酸水溶液作為流動相。
2. 1. 2 色譜柱的選擇 比較了常規 5 μm 粒徑的高效液相色譜柱和 2. 7 μm 粒徑的快速分離色譜柱。
結果表明，常規色譜柱分析時間長、流動相消耗大; 快速分離色譜柱能夠顯著縮短分離時間，且具有更高的靈敏度及更好的分離度，在中藥復雜組分的分離中更具優勢。
2. 1. 3 色譜柱的優化 實驗比較了正、負離子兩種掃描模式下的色譜峰形，結果發現負離子模式下，色譜峰較多且質譜響應較好，故選擇負離子模式掃描。另外還對其他質譜參數\\( 如毛細管電壓、碎裂電壓、錐孔電壓、干燥氣溫度、干燥氣流速、霧化氣壓力\\) 進行了優化，得到最佳的質譜條件為: 負離子模式掃描，霧化氣\\( N2\\) 壓力 345 kPa，干燥氣\\( N2\\) 流速 10 L/min，干燥氣溫度 350 ℃; 毛細管電壓4 000 V，碎裂電壓 100 V，錐孔電壓 65 V。
2. 2 癍痧涼茶化學成分鑒定在負離子模式下，大部分化合物檢測得到［M － H］－的準分子離子峰。通過分析 HPLC － MS 色譜圖中每個化合物的 TOF － MS 高分辨質譜的精確分子量信息，可以推測出化合物可能的分子式; 根據 IT －MS 的多級質譜碎片的信息則能夠推測出化合物可能的結構信息。
“黃振龍”和 “平安堂”兩種癍痧涼茶總共含有 40 個主要化學成分\\( 圖 1A 和 B 分別為 “黃振龍”及 “平安堂”癍痧涼茶的基峰離子流圖\\) ，圖中1 ～40 號峰為兩種癍痧涼茶的化學成分鑒定情況。通過與對照品比較保留時間、準分子離子峰和多級質譜碎片信息，13 個化合物得到了確證，其中 1 號峰為葡萄糖酸，2 號峰為奎尼酸，3 號峰為蘋果酸，4 號峰為檸檬酸，5 號峰為沒食子酸，6 號峰為新綠原酸，7 號峰為綠原酸，8 號峰為隱綠原酸，11 號峰為木犀草苷，15 號峰為異綠原酸 C，16 號峰為異綠原酸 A，17 號峰為異綠原酸 B，20 號峰為黃芩苷，化合物13、14、18、19 號峰推測可能為鞣花酸、野黃芩苷、薄葉黃芩甙Ⅰ、牡荊素/異牡荊素?；衔?9、10、12 號峰因缺乏對照品未能鑒定，化合物21 ～ 40 號峰具有較大的峰面積，顯示失去葡萄糖［M － 162］－的信號，從質譜信息推斷可能為三萜皂苷類化合物，由于缺乏對照品不能得到確證。表 1 給出了 “黃振龍”和 “平安堂”癍痧涼茶中的 40 個共有峰的保留時間、分子式以及 ESI － MSn產生的主要碎片離子。從化學成分分析的結果來看，“黃振龍”和 “平安堂”癍痧涼茶的主要化學成分為有機酸、黃酮類和三萜皂苷類成分，兩種涼茶的有機酸和黃酮類成分很相似，但三萜皂苷類成分的差異較大，提示兩種涼茶的配方組成和生產工藝存在一定差異。
取 21 批次 “黃振龍”癍痧涼茶樣品溶液和 20 批次 “平安堂”癍痧涼茶樣品溶液，在優化實驗條件下進行指紋圖譜分析并記錄質量色譜圖。將每個樣品的 BPC\\( Base peak chromatogram\\) 質量色譜圖導出為 . csv 文件，作為每個樣品的 HPLC － IT － MS 指紋圖譜，用于統計學分析。
2. 4 指紋圖譜方法學驗證
2. 4. 1 系統適應性試驗 取樣品 HZL01 的供試品溶液，在優化條件下，連續進樣 5 次，以綠原酸色譜峰為參照峰\\( S 峰\\) ，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果顯示各共有峰相對保留時間的 ＲSD 值不大于 0. 79%，相對峰面積的 ＲSD 值不大于 3. 7%，表明儀器分析的精密度良好。
2. 4. 2 重復性試驗 取同一批號樣品\\( HZL01\\) 6 份，分別配成供試品溶液進行測定，以綠原酸色譜峰為參照峰\\( S 峰\\) ，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的重復性。結果顯示各共有峰相對保留時間的 ＲSD 不大于 0. 40%，相對峰面積的 ＲSD 值不大于 4. 2%，表明該方法的重現性良好。
2. 4. 3 穩定性試驗 取同一批號樣品\\( HZL01\\) 的供試品溶液，分別在 0、3、6、9、12、24 h 進樣，以綠原酸色譜峰為參照峰\\( S 峰\\) ，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的穩定性。結果顯示各共有峰相對保留時間的 ＲSD 值不大于 0. 96%，相對峰面積的 ＲSD 值不大于 3. 7%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。
2. 5 主成分分析
主成分分析是利用降維的思想，在損失很少信息的前提下把多個指標轉化為幾個綜合指標的多元統計方法。本文以色譜峰的峰面積為變量，以 41 批癍痧涼茶為觀察對象，采用 SIMCA － P11. 5 DEMO統計分析軟件對 41 批次的癍痧涼茶樣本進行主成分分析。主成分個數提取原則為主成分對應的特征值大于 1 的前 m 個主成分。從方差貢獻率來看，λ1= 19. 3，貢獻率為 68. 8% ，貢獻率最大、包含的信息最多; λ2= 4. 51，貢獻率為 16. 1% 。前 2 個主成分的累計貢獻率即達 84. 9% ，對前 2 個主成分分析已經能反映癍痧涼茶的基本特征。分別以第一和第二主成分建立坐標系，進行投影即可得到所有樣本的PCA 得分圖和載荷圖，得分圖用來區分樣本，載荷圖則可以用來分析變量對樣本分類所起的作用。
圖 2A 為癍痧涼茶的二維 PCA 得分圖。圖中每個點代表一個樣本，其中 H 代表黃振龍涼茶，P 代表平安堂涼茶。從圖 2A 可看到兩種癍痧涼茶得到良好的區分。其中黃振龍涼茶\\( H01 ～ H21\\) 和平安堂涼茶\\( P01 ～ P20\\) 能夠明顯的分為兩類，代表這兩種涼茶存在著差異。
圖 2B 為癍痧涼茶的二維 PCA 載荷圖。圖中每個點代表一個色譜峰。色譜峰的系數絕對值在載荷圖中得分越高，表明該峰對樣品分類所起的作用越大。3 個主成分中，第一大主成分是特征值最大的，即 “信息最多”的指標，第一主成分中系數的絕對值越大，對樣本分類所起的作用越大。從圖 2B 能夠看到 m/z 685、793、955、727、845、889 的峰系數的絕對值最大。結合圖 2A 的二維主成分得分圖分析，可以看出 m/z 685、793、955 這三個峰與第一主成分呈負相關，并且與 “平安堂”癍痧涼茶所在區域相對應，表明這三個峰對 “平安堂”癍痧涼茶的分類起著重要作用，m/z 727、845、889 三個峰與第一主成分呈正相關，并且與 “黃振龍”癍痧涼茶所在區域相對應，說明這三個峰對 “黃振龍”癍痧涼茶的分類起著重要作用。主成分分析的結果表明，黃振龍和平安堂兩個廠家的癍痧涼茶之間的化學成分和內在質量具有顯著差異，提示配方組成及生產工藝可能不同，應該予以區分。
3 結 論
由 “黃振龍”和 “平安堂”癍痧涼茶的化學成分分析可以看出，兩種癍痧涼茶既含有相同的化學成分也含有不同的化學成分。兩種癍痧涼茶的液質聯用指紋圖譜及其主成分分析結果表明 “黃振龍”和 “平安堂”兩個廠家的癍痧涼茶之間的化學成分和內在質量具有顯著性差異，提示配方組成及生產工藝可能不同，應予以區分。本文所建立的指紋圖譜分析方法快速、高效、穩定，是癍痧涼茶質量控制的有效手段。
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