肝臟、膽囊、腸等是重要的消化器官，在食物消化、貯存、營養吸收、排泄和內分泌等方面都有著重要的作用[1].斑馬魚是常用的脊椎模式動物，它的消化器官組成結構和發育分子機制類似于哺乳動物[2].斑馬魚具有體外發育、胚胎透明、胚胎發育周期短、產卵量大等優點，突顯其在遺傳學研究上的優勢，也使得斑馬魚成為目前唯一適合于大規模遺傳篩選的脊椎模式動物[3].構建斑馬魚消化器官發育缺陷突變體有助于研究消化器官發育的分子機制，并可能用于人類相關先天性疾病的研究。本課題通過在斑馬魚中進行無基因差別的正向遺傳篩選，獲得不同消化器官發育缺陷的突變體，為后續消化器官發育分子機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 實驗動物1突變體遺傳誘變及傳代。

1. 1. 2 實驗試劑多聚甲醛、氯化鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸鈉、氯化鎂、檸檬酸、去離子甲酰胺（ 上海生工生物工程股份有限公司） ; PTU （ 1-phenyl-2-thiourea ） 、 ENU （ N-ethyl-N-nitrosourea ） 、 Tris（ pH 9. 5） 、蛋白酶 K、BSA、NBT（ nitrotetrazolium bluechloride ） 、BCIP （ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phos-phate） 、肝素、tRNA（ Sigma） ; BES-H2O2-Ac 過氧化氫熒光染料（ 日本和光純藥工業株式會社） .

1. 1. 3 實驗器材斑馬魚養殖系統（ 北京愛生科技發展有限公司） ; 熒 光 體 視 顯 微 鏡 （ Zeiss SteREO DiscoveryV20 ） ; 全自動熒光正置顯微鏡 （ Zeiss AxiolmageZ2） ; 移液器（ Gilson 10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 mL） ; 恒溫培養箱（ MemmentINE800） ; 盤旋混合儀（ 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司 KB-3-D） ;分子雜交箱（ UVP HL-2000 hybrilinker hybridizationOven / UV cross linker） ; pH 計及精密電子天平（ Mett-ler Toledo） ; 圓周式搖床（ GFL 3005 型） ; 24 孔細胞培養皿（ Costar） .

1. 2 方法

1. 2. 1 胚胎收集及處理斑馬魚交配產生的受精卵收集于 0. 03% 的海鹽水中，并于 28℃恒溫箱飼養。胚胎的發育階段依據已有報道確定[4].在胚胎 12 hpf（ hours post-ferti-lization） 起用 0. 03% PTU 處理抑制色素形成，并在3. 5 dpf（ days post-fertilization） 和 5dpf 時收集用于實驗的胚胎。

1. 2. 2 全胚胎原位雜交（ whole-mount in situ hybrid-ization,WISH）lfabp 探針合成與全胚胎原位雜交實驗依據已有報道進行[5].3. 5 dpf 胚胎用蛋白酶 K（ 1: 1000稀釋） 在 37℃ 消化 26 min.反義 RNA 探針用地高辛標記。NBT/BCIP 顯色時，室溫閉光 0. 5 ~ 1 h 即有明顯信號。

1. 2. 3 BES-H2O2-Ac（ DCFH-DA） 熒光染色BES-H2O2-Ac（ DCFH-DA） 可用 于檢測生理過程中產生的細胞源性活性氧分子（ reactive oxygenspecies,ROS） 如 O2-,H2O2,HO·等，斑馬魚胚胎發育過程中腸和膽囊可產生 H2O2,可被 BES-H2O2-Ac（ DCFH-DA） 標記[6].收集的 5 dpf 斑馬魚胚胎放入24 孔細胞培養盒中，并換上新的 0. 03% 的海鹽水。

每孔之中加入 1 μL BES-H2O2-Ac 熒光染料（ 1mg /L,溶于 DMSO） ,使稀釋度約為 1∶ 10 000,輕輕晃動，使染液迅速分散開，然后將培養盒放入 28℃恒溫箱中 1 ~2 h 后取出，在熒光顯微鏡下觀察腸和膽囊的形態發育狀況。