由于近年來對癌癥病人治療方案（化療、放療、骨髓移植）的不斷完善，癌癥患者長期存活數明顯增長，而對于許多年輕的生育期女性存活者來說，經常會出現閉經、不孕及卵巢早衰的臨床表現，但是其中許多人都希望建立家庭后可以恢復生育能力，可以擁有屬于自己的孩子，因此癌癥患者長期存活者恢復生育功能的研究成為近年來研究的熱點之一。

癌癥患者恢復生育功能有兩種方法，其中之一是采取治療方案前先手術取下一側或者部分卵巢組織冷凍保存以待長期存活后移植回體內，這樣可以生育出有自身遺傳背景的孩子。但是對于已經出現卵巢早衰而未預保留自體卵巢的患者來說要想生育出有自身遺傳背景的孩子，只能通過某些方法激活自體殘存的生殖細胞發育成熟來達到，因此另外一種有效的方法就是骨髓干細胞移植。

骨髓是機體最大的干細胞池，至少包含造血干細胞、間充質干細胞和內皮祖細胞等干細胞。骨髓干細胞是這些細胞的總稱。新研究表明成體干細胞的分化潛能超過了人們預期的想象，如骨髓衍生干細胞可分化為包括中胚層的肌肉、內胚層的肺、肝以及外胚層的腦和皮膚等多種細胞[1].

本文就干細胞向生殖細胞分化進行了初步研究。本研究選擇免疫源性低且具有免疫調節功能的雌性 BMSCs 進行雙室培養，觀察睪丸支持細胞和維甲酸誘導 BMSCs 向卵巢卵母細胞樣細胞和卵泡顆粒細胞樣細胞分化可能性，哺乳動物卵母細胞和卵泡更新是否存在以及其細胞是否來源于BMSC 及其誘導分化因素提供離體研究的證據，為卵巢早衰的產生機理及治療提供一種研究思路，也可為由于多種癌癥和其他疾病經化療、放療結合骨髓移植等方法治愈但生殖功能衰退甚至不育的年輕患者用 BMSC 移植恢復生育功能的研究提供基礎。

1 材料和方法。

1.1 方法。

二 步 酶 消 化 和 Tris-HCl 低 滲 法 分 離 12-16d SD 大鼠睪丸支持細胞，全骨髓貼壁法分離青年雌性 SD 大鼠FBMSCs ;用 MTT 比色法檢測支持細胞和維甲酸共培養骨髓干細胞的存活及增殖的影響 ;為檢測雌性骨髓干細胞分化情況，用 RT-PCR 檢測生殖干細胞由有絲分裂轉變為減數分裂前特異表達基因 stra8 mRNA 及卵巢顆粒細胞特異表達基因 fshr mRNA 的表達。

1.2 材料。

1.2.1 儀 器 :CO2細 胞 培 養 箱（MCO-17AC, 日 本SANYO 公司），超凈工作臺（蘇州凈化儀器 SW-CJ-IF）普通離心機（Anke TGL-16B），.XSZZ-D2倒置生物顯微鏡（重慶光學儀器廠）。652- 酶聯免疫檢測儀（Labsystems,芬蘭），紫外分析儀（北京市六一儀器廠），PCR 擴增儀（杭州朗基公司），超速低溫離心機 :（Beckman 公司），雙室培養系統（transwell insert）（Corning 公司）。

1.2.2 試 劑 :DMEM 細 胞 培 養 液，Tris-HCl 緩 沖 液（20mmol/L），雙抗液，四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液，新生牛血清（NBS），胎牛血清（FCS）膠原酶Ⅳ，胰蛋白酶，透明質酸酶（上述三種酶液均用 0.01mol/L PBS 緩沖液配制，使用終濃度分別為 :1）1.0mg/ml ;2）0.8mg/ml ;3）1.0mg/ml），RT-PCR 有關試劑（Trizol,RT-PCR 試劑盒，無核酶水，DL2000（marker），Taq PCR MasterMix 瓊脂糖，引物 primer GAPDH :（產物長度為 728bp）。

1.2.3 動物 :10 ~ 12 日齡的健康 Sprague-Dawley（SD）雄 性 乳 鼠， 體 重 15g ~ 19g ;4 ~ 100g 的 健 康 青 年Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠。

1.3 方法。

1.3.1 睪丸支持細胞的分離和培養 頸椎脫臼法處死乳鼠。在無菌條件下切開皮膚，取出睪丸，在冰面上剝除睪丸被膜，剔除周圍血管，然后用 PBS 沖洗睪丸實質，將睪丸剪成 1-2mm3的碎塊。將碎塊置于 2.5mg/ml 的 V 型膠原酶中，在 37℃震蕩消化 15-20min,至組織碎塊變成索狀結構，用 PBS 清洗 3 次，離心（1000r/min,5min）收集細胞，再放入 0.25% 的胰酶中，在 37℃消化 15-20min,用含有10% 新生牛血清的 DMEM 培養液終止消化，離心（1000r/min,5min）收集細胞，重懸后用 200 目不銹鋼網過濾，靜置 5min,取下層細胞，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 重懸細胞，. 接種 24h 后，吸出培養液，加入低滲 Tris-HCl 2ml/孔，以除去精原細胞，作用 2min 后，加入 PBS 沖洗 2 次，再加入培養應用液重新培養，培養后備用。

1.3.2 雌性大鼠骨髓干細胞的分離和培養 將 SD 雌性大鼠處死，在無菌條件下取出股骨和脛骨。將股骨和脛骨的兩端剪開，用 DMEM 培養液（10%FCS,100U 的雙抗液）反復沖洗髓腔，以每瓶 1×107接種于培養瓶中，置于培養箱（37℃，5%CO2）中培養，培養 3 天后首次換液，以后隔 2 天換液。培養七天左右，細胞鋪滿單層后，加入 0.25%胰酶（含 0.02%EDTA）1ml 消化傳代，待細胞長至 70% 鋪滿時再傳代培養。

1.3.3 研究睪丸支持細胞對雌性骨髓干細胞存活、增殖中的影響 采用 corning transwell insert 進行共培養，取第二代 BMSCs,以 2×105/ 孔接種至 12 孔板中，分成 2 組，對照組、共培養組接種七塊培養板，每天取一個培養板進行用 MTT 法檢測細胞生長情況，連續觀察七天。采用方差分析對結果進行分析統計。

1.3.4 研究睪丸支持細胞對骨髓干細胞向 stra8+及 FSHR+細胞分化的影響 采用 corning transwell insert 進行共培養，取第二代 BMSCs,以 2×105/ 孔接種至 12 孔板中，分成 2組，對照組、共培養組，以不加藥物和無共培養的 BMSCs作為對照，4h 后將接種有睪丸支持細胞的 transwell 小皿與BMSCs 一起共培養 7 天，用 RT-PCR 檢測 Stra8、FSHR的表達 :選用 GAPDH 作為內參，所用引物參見實驗試劑。理論上推算 RT-PCR 擴增片段長度 :stra8 為 171bp,GAPDH 為 728bp,FSHR 為 498bp.Stra8 PCR 反應參數 :94 ℃ ×5min→ 94 ℃ ×45sec,60℃ ×45sec,72℃ ×45sec,共 35 個 循 環 → 72 ℃ ×5min.FSHR PCR 反 應 參 數 :94 ℃ ×5min→ 94 ℃ ×45sec,62℃ ×45sec,72℃ ×60sec,共 40 個循環→ 72℃ ×5min.各組取 8μl 擴增產物，進行 1%瓊脂糖凝膠電泳（含溴化乙錠 5μl/ml），紫外燈下觀察結果、拍照，將 stra8 和 FSHR 條帶作為骨髓干細胞分化的指標。

采用 SPSS12 軟件進行統計學處理，所有定量檢測指標均采用 x±s 表示，進行方差齊性檢驗、單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較用 LSD 法。以 P<0.05 為顯著性差異。