神經干細胞（ NSCs） 廣泛存在于胚胎和成年哺乳動物中樞神經系統，是一類具有分裂潛能和自我更新能力的前體細胞，它可以通過對稱分裂和不對稱分裂方式進行自我更新并產生神經組織的各類細胞，包括神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等[1].NSCs 的發現為神經系統變性、損傷性疾病的修復、治療開辟了新途徑。已有研究表明，非必需氨基酸（ NEAA） 和 β-巰基乙醇能夠促進小鼠胚胎干細胞向 NSCs 轉化[2],但目前尚無 NEAA 和 β-巰基乙醇對孕 14. 5 d 來源胎鼠的 NSCs 作用的相關報道。本文進行了相關探討。
1 材料與方法。
1. 1 材料 實驗動物： 孕 14. 5 d 雌鼠購于昆明醫科大學實驗動物中心，合格證號： SCXY（ 滇） -2014004.試劑： 達爾伯克改良伊格爾培養基-F12 營養混合物（ DMEM-F12） 培養基，神經基礎培養基（ NeuronalBase） ,NEAA,β-巰基乙醇，青 / 鏈霉素（ P / S） ,谷氨酸混合物，0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ Trypsin-ED-TA） ,胎牛血清（ FBS） ,牛血清蛋白（ BSA） 均購自 Gib-co 公司。B27,噻唑藍（ MTT） 購自 Sigma 公司。表皮細胞生長因子（ EGF） ,堿性纖維生長因子（ bFGF） ,巢蛋白（ Nestin） ,神經元Ⅲ類 β 微管蛋白（ TUJ-1） ,膠質纖維酸性蛋白（ GFAP） 購自 Millipore 公司。PCR 逆轉錄試劑盒購自寶生物工程有限公司，其他 RT-PCR試劑購自 ABI 公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ GAPDH）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（ Caspase-3）基因引物由 Invitrogen 公司合成。GAPDH: F:5'-GCT-TCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'; R: 5'-TTGGCTC-CACCCTTCAAGTG-3'. Caspase-3: F: 5'-ACCGAT-GTCGATGCAGCTAA-3'; R: 5'-GGTGCGGTAGAGTA-AGCATA-3'.
1. 2 培養基的配制 NSCs 原代培養基： 向 DMEM /F12 培養基內加入 2 mmol / L Gluta MAX,2 mmol / LP / S,4 mmol / L B27,20 ng / mL EGF 和 20 ng / mLbFGF.NSCs 傳代培養不含 P / S,其余與原代培養基相同。NSCs 貼壁培養基： 向 DMEM/F12 培養基內加入 50% Neuronal Base、1% BSA、2 mmol/L GlutaMAX、4 mmol / L B27、20 ng / mL EGF 和 20 ng / mLbFGF.NSCs 分化培養基： 向 DMEM / F12 培養基內加入 50% Neuronal Base、0. 5 % FBS、2 mmol/L Glu-ta MAX、4 mmol / L B27.
1. 3 小鼠 NSCs 的分離和培養 取孕齡為 14. 5 d的雌鼠，三溴乙醇安樂死后無菌操作取出胎鼠前腦的側腦室顆粒下層（ SVZ） ,剪碎，使用 400 μL 的0. 05% Trypsin-EDTA 于 37 ℃ 消化 10 min,每 5 分鐘吹打 1 次，使用 DMEM-F12 培養基終止消化。將細胞懸液在12 000 g、4 ℃離心10 min,棄上清，使用1 mL NSCs 原代培養基重懸細胞后將 NSCs 種于 12孔板。體外培養 7 d,NSCs 會形成生長成熟的神經球，將生長成熟的神經球進行傳代。具體操作： 將神經球吸入到 1. 5 mL 離心管，800 g、4 ℃離心 5 min,棄上清，使用 400 μL 胰酶消化 3 min,使用 DMEM-F12 培養基終止消化。將細胞懸液在 800 g、4 ℃ 離心 5 min,棄上清，使用 NSCs 傳代培養基重懸細胞，細胞計數，以 2 ×105/ 孔將 NSCs 種于 12 孔板，每孔含傳代培養基 1 mL.傳代的 NSCs 在體外培養 3 d會形成成熟的神經球，繼續將神經球傳代。5 ~7 代NSCs 用于本實驗。
1. 4 分組及 NSCs 的處理 NSCs 傳代后以 2 × 105/ 孔種于12 孔板，分為四組，對照組： 加入磷酸鹽緩沖液（ PBS） 12 μL; NEAA 組： 加入 NEAA 10 μL,PBS 2 μL;β-巰基乙醇組： 加入 β-巰基乙醇 2 μL,PBS 10 μL;NEAA + β-巰基乙醇組： 加入 NEAA 10 μL,β-巰基乙醇2 μL.NEAA 濃度為 1% ,β-巰基乙醇濃度為 0. 1mmol / L.NSCs 以 1. 0 × 105/ 孔 種 于 多 聚 鳥 氨 酸（ 0.01%） 包被過的24 孔板，每孔加入0.5 mL NSCs 貼壁培養基，體外培養48 h,進行免疫組化染色，對 NSCs鑒定。本試驗所用細胞為傳代5 ~7 代的 NSCs,所有細胞能染色 Nestin,提示我們所用細胞為 NSCs.
1. 5 NSCs 增殖速度的測算 用于實驗的 NSCs 使用傳代培養基以 2 ×105/ 孔種于 12 孔板，按分組給予處理（ 同 1. 4） ,并懸浮培養。48 h 后收集神經球，吹散，消化后使用血細胞計數器進行活細胞計數。增殖速度 =48 h 后收集的活細胞數/2 ×105.
1. 6 NSCs 增殖率的測算 采用 MTT 法。NSCs 以0. 1×105/ 孔種于多聚鳥氨酸（ 0. 01% ） 包被過的 96 孔板，每孔加入0.2 mL NSCs 貼壁培養基并按分組給予處理（ 同1.4） ,體外培養48 h,加入 5 mg/mL 的 MTT 在 37℃作用 4 h,去除培養基，加入二甲基亞砜 150 μL / 孔，室溫下搖床上孵育15 min,使用酶標儀（ Turner BioSys-tems 公司） 450 nm 測定吸光度（ A 值） .
1. 7 NSCs 中 Caspase-3 mRNA 的檢測 采用 RT-PCR 法。用于實驗的 NSCs 使用傳代培養基培養，并進行分組及處理（ 同 1. 4） .48 h 后收集神經球，加入總 RNA 抽提試劑，提取總 RNA.其余步驟按試劑盒說明書進行。
1. 8 GFAP、Nestin 陽性細胞數的測算 采用免疫組化染色法。NSCs 以 0. 5 × 105/ 孔種于 多聚 鳥 氨 酸（ 0.01%） 包被過的24 孔板，每孔加入0.5 mL NSCs 分化培養基，體外培養 7 d,進行免疫組化染色（ TUJ-1、Nestin、GFAP） ,對 NSCs 向神經元和星形膠質細胞分化比例進行測定。具體步驟按試劑盒說明操作，鏡下觀察，拍片。Image J 軟件計算陽性細胞所占百分比。
1. 9 統計學方法 采用 SPSS17. 0 統計軟件。計量資料以珋x ± s 表示，多組間比較用單因素方差分析。P < 0. 05 為差異有統計學意義。
2 結果。
各組 NSCs 增殖速度、細胞增殖率、Caspase-3mRNA、TUJ-1 陽性細胞、GFAP 陽性細胞、Nestin 陽性細胞比較見表 1.
3 討論。
近年隨著我國人口的迅速老齡化，中樞神經系統退行性疾病日益增多。雖然目前已有研究報道利用 NSCs 移植治療阿爾茨海默病、亨廷頓病、多發性硬化、中風、脊髓損傷等神經退行性疾病[3,4],但是NSCs 移植治療始終存在免疫排斥[5]和倫理學的挑戰。1992 年 Reynolds 等[6]從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出 NSCs,確定在成熟的中樞神經系統有NSCs 的存在。神經損傷后，通過內源性及外源性刺激，促進神經新生，即促進機體自身的 NSCs 增殖、分化以修復受損的組織是 NSCs 研究的主要目的[7].尋找安全有效的藥物來促進自體神經新生一直是 NSCs 研究者努力的方向。
本研究中我們選擇孕 14. 5 d 的雌鼠，提取其胎鼠的前腦 SVZ 區經胰酶消化后獲得 NSCs 進行培養。如果雌鼠的孕期短于14 d,其胎鼠的腦發育差，腦體積小，腦組織不飽滿，完整地提取胎鼠前腦的實驗操作難度加大。更重要的是，由于發育時間短，胎齡過小的胎鼠腦提取出的 NSCs 數量少、質量差，難以長期傳代。如果胎齡大于 15 d,NSCs 已經開始向神經元發育，NSCs 的增殖能力差會影響實驗結果，造成較大實驗偏差。細胞活性的高低可以反映細胞的增殖能力[8].細胞增殖速度是衡量細胞增殖的另一項常用指標。
本研究中 NEAA + β-巰基乙醇組細胞增殖率及增殖速度最高，NEAA 組及 β-巰基乙醇組高于對照組。說明 NEAA 和 β-巰基乙醇均具有促進 NSCs 增殖的作用，聯合作用效果更佳。Caspase-3 是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[9],其裂解活化直接導致細胞 死 亡[10].本 研 究 發 現，1% NEAA 和 0. 1mmol / L β-巰基乙醇均可降低 Caspase-3 mRNA 表達，聯合作用效果更強。提示 NEAA 和 β-巰基乙醇均具有抑制 NSCs 細胞凋亡的作用。本研究中的 β-巰基乙醇組及 NEAA + β-巰基乙醇組 TUJ-1、GFAP陽性細胞百分比均降低，Nestin 陽性細胞百分比升高，以 NEAA + β-巰基乙醇組為著，提示 β-巰基乙醇具有抑制 NSCs 向神經元及星形膠質細胞分化的作用，以聯合應用效果更佳。（表略）
參考文獻：
[1]Guo W,Patzlaff NE,Jobe EM,et al. Isolation of multipotent neu-ral stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subven-tricular zone of a single adult mouse[J]. Nat Protoc,2012,7（ 11） : 2005-2012.
[2]Freitas-Correa L,Lourenco MV,Acquarone M,et al. 2,4-Dinitro-phenol induces neural differentiation of murine embryonic stemcells[J]. Stem Cell Res,2013,11（ 3） : 1407-1416.
[3]Hedayatpour A,Ragerdi I,Pasbakhsh P,et al. Promotion of remyeli-nation by adipose mesenchymal stem cell transplantation in a cuprizonemodel of multiple sclerosis[J]. Cell J,2013,15（ 2） : 142-151.
[4]Greenberg ML,Weinger JG,Matheu MP,et al. Two-photon ima-ging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural pre-cursor cells in a viral model of multiple sclerosis[J]. Proc NatlAcad Sci USA,2014,111（ 22） : E2349-E2355.
