肝臟是體內功能最多且最復雜的實質臟器，主要功能包括參與物質代謝、膽汁的生成和排泄、生物轉化、分泌性蛋白質的合成、凝血物質的生成與消除，并在特異性和非特異性免疫中具有重要作用[1].肝臟作為人體物質代謝的中心，在多種生理和病理過程中都發揮了重要的作用，很多疾病也會累及肝臟。肝細胞作為肝臟內最主要的實質細胞類型，生理狀況下占 80% ~ 90%,行使了肝臟主要的功能，如參與內分泌調節、代謝多種營養物質、清除毒素、儲存葡萄糖、合成凝血因子和血清白蛋白及多種消化酶等[2].肝細胞屬于上皮型細胞，體外培養后具有貼壁生長的能力，長期穩定地大規模體外培養活力旺盛、形態和功能良好的肝細胞在肝細胞移植、基因治療、藥物研發和藥代動力學研究及藥物毒性評價等方面具有非常廣泛的用途[3-4].本文擬對原代肝細胞常見的分離方法與培養方法做一綜述。
1 原代肝細胞的分離
肝細胞的分離方法有很多種，包括非灌流法和灌流法。非灌流法包括直接分離法、肝組織塊外植培養和酶消化法等；灌流法中的兩步原位灌流法是普遍公認的經典分離方法，經此法分離出的肝細胞產率高，存活率高，細胞維持肝細胞功能時間較長。
1.1 直接分離法
將動物麻醉或處死后，取出肝臟并剪成小塊，通過擠壓、剪碎、振蕩、吹打等機械方法使肝細胞從肝臟組織上脫落，得到單個肝細胞。也可與 EDTA 螯合法、灌注法相結合，即先用 EDTA 溶液進行充分灌流，再剪成組織小塊，然后用研磨或剪切的方法分離獲得肝細胞[5-6].此法的優點是操作流程短，不需要昂貴的膠原酶和復雜的儀器，但此法得到的肝細胞數量較少，成活率低。
1.2 肝組織塊外植培養
1 ~ 3 天齡乳鼠經脫頸處死后，用碘酒酒精消毒腹部，然后迅速取出肝臟后置于培養皿中，將肝組織剪成 1 mm3左右的小塊。用吸管吹打，待組織沉淀后吸出上清液，反復洗滌肝組織塊，最后加入含血清的培養基沉淀組織塊。然后直接將肝組織塊植入培養瓶中。開始時可加少量培養基以免細胞塊漂浮，置于 37℃細胞培養箱中培養。也可在肝組織塊用完全培養基沉淀后加入 IV 型膠原酶和 PVP 消化液于 4℃過夜。消化完全的組織塊可用吸管吹打使其散開，在得到的細胞懸液中加入血清，置于 4℃一段時間后，換液去除浮于懸液中的血細胞及組織碎片，而多數上皮細胞沉于管底。將細胞懸液離心后，加入完全培養基重懸后種于培養瓶中進行培養[7].此法操作簡單，肝細胞容易貼壁且可進行后續傳代培養，但其影響因素較多，肝細胞密度不易掌控且組織塊能否游離出肝細胞無法確定。
1.3 酶消化法
包括胰酶消化法和膠原酶消化法兩種。麻醉或處死動物后，將肝組織用緩沖液充分清洗，加入胰酶或膠原酶消化完全，若此步驟中使用胰酶則需加入含血清的培養基終止其消化作用。之后通過吹打等方法將肝細胞收集于培養基中，制備出單細胞懸液。
胰酶消化法操作簡單，費用低，但分離的細胞數量有限、純度較差，且胰蛋白酶消化的條件較難掌握，所以現在應用較少。而膠原酶消化法則具有損傷較小、細胞產率高，細胞可在較長時間內維持肝特異性功能等優點，但膠原酶價格昂貴，因此成本較高。除上述提到的直接膠原酶消化法，現在此法多與灌流法相結合，包括半原位膠原酶灌流法以及下面即將闡述的經典的兩步原位膠原酶灌流法。
1.4 兩步原位膠原酶灌流法
即 Seglen 灌流法[8].將動物麻醉后，固定于超凈臺上，在無菌條件下打開腹腔，分離并結扎門靜脈，吸取肝臟灌流液從門靜脈注入肝臟，后剪斷下腔靜脈，肝臟沖洗干凈后，注入膠原酶緩沖液進行消化。消化完成后，將肝臟剪下，研磨剪碎，加入培養基后多次離心，將沉淀置于 Percoll 分離液上層，離心后棄上清，沉淀的細胞用完全培養基重懸得到分離好的肝細胞懸液[9-10].此方法分離培養出的肝細胞數量多、存活率高、形態好，能夠較好的分離出肝實質細胞和非實質細胞，且保留肝細胞的功能，是原代肝細胞分離培養的經典方法[11].但其操作流程復雜，技術要求高，所需時間長，易污染，成本高，因此不易在一般實驗室開展?，F已有很多學者對此法進行不斷改良使其可以更廣泛的應用。
2 原代肝細胞的培養
原代肝細胞的培養方法有很多種，包括單層培養法，雙層培養法，微載體粘附培養法，球形聚集培養法，微囊培養法和中空纖維培養法等[12-13] .在這里將主要介紹前三種較為常用且培養效果較好的方法。
2.1 單層培養法
將分離出的細胞懸液接種于預先涂有膠原的培養皿中并置于細胞培養箱中培養，細胞貼壁后開始增殖，并形成最初的一鋪展層。肝細胞屬于上皮細胞，體外培養后具有貼壁生長的能力。此法操作簡單，細胞形態和功能在短時間內可維持較高水平，且便于觀察和應用于實驗，因而目前廣泛應用于各實驗室，但由于接觸性抑制，不易進行大規模培養。而 Tilles 等在平板載體中添加產氧薄膜，從而增加肝細胞可附著的面積和培養體系中的氧含量，使肝細胞產量大大提高，并延長了肝細胞維持功能的時間[14].
2.2 雙層培養法
即膠原凝膠三明治培養法，是一種常用的三維細胞培養方法。先在培養皿底部鋪入第一層膠原，待其凝固形成膠原膜后加入分離好的細胞懸液，置于細胞培養箱培養；肝細胞貼壁后，再加入第二層膠原，待其凝固后，在上面再加入培養液，形成多層結構[15].
該法為肝細胞提供了良好的環境，有助于維持細胞功能如合成分泌白蛋白、尿素等，并且細胞生長狀態良好，但膠原價格昂貴，且此法對于技術要求較高。
2.3 微載體黏附培養法
此法原理是在微載體間隙中加入新分離的肝細胞懸液，通過振動促使肝細胞黏附于微載體并進行培養。將分離的肝細胞和微載體加入培養液中，使肝細胞附著到經膠原被覆的聚糖載體（Cytodex3 或 Biosilon 微載體）上進行培養[16].微載體為細胞提供了較大的貼壁生長表面積和三維空間，微載體的懸浮狀態可使細胞進行充分的物質交換，其支撐作用可維持肝細胞形態及功能，可進行大規模培養。但細胞較易失去正常的分化功能，營養供給等理化因素可能對細胞的增殖和存活產生影響，安全性有待確定，且此法操作步驟較多，如微載體需進行預先水化和消毒，以及通過預實驗來確定微載體的類型。
3 問題與前景
目前，原代肝細胞的分離和培養技術已經取得了很大進展，也已建立了許多細胞模型應用于各項研究，如肝炎病毒體外感染模型的建立，用肝細胞缺氧、缺糖模型來模擬體內肝缺血狀態，以及癌變模型來研究致癌因子和肝癌的防治；還可利用原代肝細胞進行生物人工肝的臨床應用及肝細胞移植的相關研究[17-18].由于肝細胞在體外可維持肝臟的代謝功能，尤其是細胞色素 P450 酶的水平與體內相比有較高的一致性，可在細胞水平上提供重要相關信息，如吸收、轉運、代謝等，因而被廣泛應用于藥代動力學和毒理學研究中，可為藥物研發做出重要貢獻[19-20].
原代肝細胞分離培養成功的影響因素有很多，如選材、分離方法、生物材料、培養液、細胞密度、細胞骨架、細胞外基質構象和介質等，需要在實際操作中不斷總結以獲得最佳方法。除此之外，還有一些為了更好的應用于各項研究我們需要解決的問題：
如何在分離肝細胞時提高其存活率；如何在分離培養中降低成本、提高效率；體外培養的肝細胞功能狀態與體內肝細胞仍存在明顯差距，除具有正常肝細胞功能外，還存在一些特異功能，易在應用中引起不良反應，可能無法滿足長期替代治療所需，如何調整加以完善使體外培養的肝細胞更好的模擬體內環境。
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