目前大量關于腎的毒理學、藥物測試等研究需要腎小管上皮細胞株。但是，細胞株部分基因的變異或缺失與正常細胞存在差異，原代細胞在表達正常細胞生理狀態下則更顯優勢[1],因此尋求一種有效的腎小管上皮細胞的原代培養尤為重要。目前多篇文獻[1-7]對腎小管上皮細胞的原代培養都有各自見解，本實驗將其簡化并加以改良，在文獻的基礎上[2]優化實驗條件，尋找經濟材料以及合適的濃度以獲得大量良好的腎小管上皮細胞。在試驗中發現將第一次細胞換取液可再次利用，仍有大量高純度的腎小管上皮細胞貼壁且貼壁良好。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：SD 大鼠，雄性，4~5 周齡（徐州醫學院實驗動物中心）；昆明小鼠，4~5 周齡（徐州醫學院實驗動物中心）。

1.2 主要試劑胎 牛 血 清（杭 州 四 季 青），DMEM-F12 1:1 培 養 基（Thermo），Ⅰ型膠原酶 （ 美國 Sigma），胰酶消化液，雙抗（青霉素 - 鏈霉素溶液 100×），兔抗人角蛋白 CK18（Bioss），SABC免疫組化染色試劑盒（博士德生物），DAB 顯色試劑盒（博士德生物）。

1.3 試驗方法

1.3.1 腎小管節段分離

大鼠和小鼠實驗前均禁食 12 小時，進水自由。脫臼處死，75% 乙醇中浸泡 5min.在超凈臺中取出腎，置于冷的含雙抗的 PBS 溶液中，去除腎蒂和包膜，將腎皮質剪碎大小至1mm3,PBS 洗滌 3 次后，放置 80 目不銹鋼篩網上，用 50ml滅菌注射器柄輕輕研磨，PBS 液充分清洗后的網下液轉移至100 目不銹鋼篩網中，將 100 目篩網倒置 PBS 沖洗取網上液。

取得的液體經 1500r/min 離心 8min,棄去上清液在沉淀中加入Ⅰ型膠原酶，分別 37℃振蕩消化，振蕩消化時間分三組，分別為 20min,25min,30min.雙倍體積 DMEM-F12 培養基中和后，1500r/min 離心 8min.

1.3.2 腎小管上皮細胞的原代培養及傳代

在 上 述 離 心 后 的 沉 淀 中 加 入 含 10% 胎 牛 血 清 的DMEM-F12 培養基，輕輕吹打混勻。接種到 25mL 培養瓶中。培養瓶靜置于 37℃ 5% 的 CO2培養箱中培養。24h 后補加培養基。72h 后首次換液。之后隔天換液。原代培養 4~6 天，細胞貼滿瓶底，用胰蛋白酶消化并傳代培養。

1.3.3 首次換液后廢液的有效利用

72h 首次換液時，將廢液至于新的培養瓶中，添加適當的培養基，靜置于 37℃ 5% 的 CO2 培養箱中培養。視細胞貼壁狀態可于 48h 半換液，72h 全換液。

1.3.4 腎小管上皮細胞的鑒定1.3.4.1 倒置顯微鏡下對細胞的形態及生長進行觀察1.3.4.2 免疫細胞化學法（SABC 法）細胞爬片后，PBS 輕輕沖洗。4% 多聚甲醛固定 60min.

吸去多聚甲醛后空氣干燥 5min,加入 30%H2O2純甲醇（1:50）混合液浸泡 30min,滅活內源性過氧化物酶，PBS 沖洗；加 5%BSA 封閉液，室溫條件 20min,吸去多余液體；加兔抗人角蛋白 CK18（1:200），PBS 作為陰性對照。37℃下孵育 1h,PBS 洗滌 3 次。加入生物素化山羊抗兔 IgG（博士德生物）室溫 20min,PBS 洗滌 3 次，加 SABC 37℃反應 20min,洗片，使用 DAB 試劑盒（AR1002）顯色，蘇木素輕度復染，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 SD 大鼠和昆明小鼠腎小管上皮細胞分離生長和傳代的比較

SD 大鼠剛分離的以腎小管節段以及單個游離腎小管上皮細胞，在倒置顯微鏡下圓形透亮，體積較大，強折光性好。（ 圖 1）12h 后部分細胞開始貼壁，以腎小管節段周圍聚集密集。24h 后細胞大量貼壁且有少量上皮樣細胞爬出，72h 細胞緊密銜接呈典型鵝卵石鋪路樣，折光性好。（圖 2）SD 大鼠傳代至第二代時開始有細胞漂浮，傳代到第三代時大量凋亡。昆明小鼠剛分離的腎小管以腎小管節段居多，形態與大鼠相似。（圖 3）貼壁速度比 SD 大鼠略慢，但生長速度快，培養 72h 已長滿瓶底。（圖 4）傳代至第三代時依舊有大量細胞緊貼瓶底。

2.2 膠原蛋白不同時間的消化結果

SD 大鼠分離出的 100 目網上液，37℃環境下，膠原酶消化 20min 腎小管節段較多，于 36h 已開始貼壁，72h 后貼壁達45%,生長狀態較好，純度較高。細胞傳代至第二代細胞活性降低，細胞開始凋亡漂浮。膠原酶消化 25min 腎小管節段以及游離細胞明顯增多，24h 有部分細胞貼壁，原代培養 36-72 h 有上皮細胞從周邊長出呈島嶼狀，（圖 5）細胞傳代到第三代開始有少量細胞漂浮，生長緩慢。膠原酶消化 30min 游離腎小管上皮細胞居多，貼壁生長均緩慢。傳代到第二代細胞呈老化狀態。

2.3 首次細胞換取液中腎小管上皮細胞的培養和傳代

昆明小鼠培養 72h 后，首次細胞換取液中存有大量腎小管節段和游離腎小管上皮細胞，形態與上述腎小管上皮細胞相似，還有少許雜質。（圖 6）換取液培養 12h 后細胞開始貼壁，生長狀態良好。（圖 7）48h 后大量貼壁，換液后可見細胞呈島嶼狀分布。3~4d 后細胞鋪滿瓶底，純度稍低。（圖 8）傳代后的第一代和第二代貼壁生長較好，第三代細胞開始漂浮。

2.4 腎小管上皮細胞的鑒定

免疫細胞化學染色檢測腎小管上皮細胞特異性表達的cytokeratin18,在鏡下可見腎小管上皮細胞的胞核周圍及胞質內有不均勻分布的棕褐色顆粒，（圖 9）而陰性對照組未見到，（圖 10）證明培養的是腎小管上皮細胞。CKl8 免疫細胞化學染色顯示，細胞質中有棕黃色顆粒，分布不均，強弱不等，幾乎全部細胞質均著色，顯示為 CKl8 陽性。

3 討論

近年，國外主要用 RTECs 株開展對腎小管上皮細胞的研究，但價格昂貴，國內獲得困難[1].目前國內原代培養的腎小管上皮細胞主要采用流式細胞儀分離法[3],微鏡下解剖分離法，免疫分離等方法能獲得高純度的腎小管上皮細胞，但需要具備嚴格的條件以及高要求高難度的分離操作。從對細胞的需求數量和需要的純度考慮，機械研磨膠原酶消化法經濟且應用廣，分離方便。本實驗腎小管上皮細胞分離的實驗步驟進行探討，通過大量實驗對比，尋找操作簡便可行且經濟的方法。實驗中獲得以下幾點經驗：

（1）嚴格保持無菌，可在操作的試劑 PBS 以及培養基中加入雙抗，雙抗對細胞毒性小，可有效減少細胞感染率。細胞培養過程中，前三天在培養基中使用抗生素抗污染效果較好[4].解剖和腎提取過程中可將解剖臺裝有 PBS 液的培養皿置于冰上，盡量保持在 4℃左右。

（2）選擇 1 型膠原酶，不采用含 EDTA 的膠原蛋白消化[2],消化時間在 25min 左右獲得的腎小管上皮細胞數量多活性好。

（3）實驗過程中發現將分離出的腎小管上皮細胞第一次接種時，添加少量培養基，細胞能更好的貼壁，培養 24 小時后適當添加培養基。

（4）進行 Pereoll 連續或不連續密度梯度分離法[5,6]純度高，但分離液價格較貴，按要求吸取近管底第二層懸液后，所獲得細胞數量明顯減少，且反復離心增加對離體細胞的損害。這與另一篇文獻中提到腎小管經過 80 目和 100 目孔徑的不銹鋼篩網分離后，其純度可達到 90%以上，且獲得的細胞數量較多[7]的觀點一致。

（5）4~5 周的 SD 小鼠腎體積小，去除腎蒂和包膜較困難，故一次實驗需兩到三只小鼠才能分離出較多腎小管節。雖小鼠細胞貼壁速度慢，但生長速度快，傳代能力強，經濟實惠。

（6）在細胞生長觀察中可發現細胞多呈群落樣生長貼壁，當貼壁達 60% 換液后，已貼壁的細胞生長迅速，48h 后就可爬滿瓶底。而貼壁過滿再換液，由于細胞培養瓶內貼壁空間的限制以及細胞產生的廢棄物影響細胞生長。

（7）機械研磨法分離腎小管上皮細胞多，培養 48h 后大量細胞貼壁，但培養瓶中還有大量未貼壁的腎小管節段及游離的細胞。將第一次換液后的廢棄液繼續培養，培養 48h 后依舊有大量腎小管上皮細胞貼壁，且貼壁快。首次換取液中細胞的純度不影響對腎小管上皮細胞的研究。第一代傳代細胞貼壁生長均較好，對細胞需求多的研究具實用價值，且經濟方便。

8.在分離出的腎小管上皮細胞液中加入胰島素，上皮生長因子，轉鐵蛋白等可以提高細胞活性，已有文章表明維生素 C 對腎小管上皮細胞體外培養時間起適度延長作用且對細胞活力有增強作用[8].

9.腎小管上皮細胞胞漿中特異性表達 CKl8,因此用cKl8 對原代和傳代細胞分別進行鑒定[9].

參考文獻

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