MSC 具有多項分化潛能，容易分離培養，是組織工程研究常用種子細胞之一[1].bFGF 基因轉染 MSC 的過程、轉染時限、效率、評估手段一直臨床亟待解決的問題。探討通過以病毒為載體，體外構建 bFGF 基因轉染 MSC 的方法，為進行 MSC 相關研究提供實驗基礎。具體報道如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取 SD 大鼠（中國醫科大學提供），體重為 150 g.

1.2 主要試劑及儀器

DMEM（美國 GIBCO）；FBS（美國 ExCell Biology）；bFGF（武漢博士德生物）；CO2培養箱（日本 SANYO）；生物倒置顯微鏡（日本 OLYMPUS）；高速冷凍離心機（德國 Sorvall）；WesternBlot 抗體清除緩沖液（南京凱基生物科技發展有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞培養 取健康成年 SD 大鼠，斷頸處死后，常規消毒，取雙側股骨和脛骨，去掉附著在骨表面的軟組織后，暴露骨髓腔，吸取 DMEM 培養液，洗凈骨髓腔后，抽取骨髓，制成單細胞懸液，離心處理 20 min,去除上清，添加完全培養液進行重懸，將細胞懸液接種在培養瓶中，防置在 37℃、5%CO2飽和濕度中進行細胞培養。每 3 天換液 1 次，待細胞匯合 80%時，添加胰蛋白酶和EDTA 進行消化，依據 1 :2 進行傳代培養。取 3 代細胞，分為正常組、陰性組和 bFGF 組。

1.3.2 病毒轉染細胞 bFGF 組將 MSC 細胞配制成細胞懸液后，滴加到細胞培養孔中，加入優化培養基和 Ad.bFGF 液，終濃度達 5 μg/ml 時，混勻，培養 24 h 后，更換培養基繼續培養 48 h.

1.3.3 免疫組化染色檢測 bFGF 表達 細胞樣本經多聚甲醛固定液浸泡后，用 PBS 浸洗 3 次，滴加即用型山羊血清，室溫孵育，滴加一抗，37℃下濕盒孵育 2 h,添加增強劑，室溫濕盒孵育 30 min,添加二抗，室溫孵育 30 min,添加 DAB 顯色劑，常規復染、脫水和封固后，鏡下觀察細胞形態和染色深淺。

1.4 觀察指標

應用顯微鏡觀察細胞形態改變，并應用 Western- Blot 法分析bFGF 基因表達情況。

1.5 統計學方法

應用 SPSS14.0 軟件，計量數據組間比較用單因素方差分析，P < 0.05,差異具有統計學意義。

2 結果

正常組原代細胞體外培養 24 h 后，可見微量圓形貼壁細胞；72 h 后，貼壁細胞增多，具有成纖維細胞的典型形態。傳代培養24 h 后，基本完成貼壁；5 天后細胞成梭形，胞體飽滿，保持原代細胞形態特征。陰性組和正常組均未見轉染 bFGF.bFGF 組 MSC細胞胞漿呈黃色，出現細胞染色現象。見圖 1.Western-Blot 分析顯示陰性組和正常組未見 bFGF 表達，bFGF 組樣本可見特異性條帶，其表達量為 0.85,與 bFGF 分子量一致，轉染細胞 bFGF 陽性表達高于正常組及陰性組，P > 0.05,差異不具有統計學意義。見圖 2.

3 討論

BFGF 能夠促進 MSC、成骨細胞以及血管內皮細胞增殖，對于細胞發育以及組織修復具有積極作用，是調控 MSC 定向分化的主要生長因子之一[2].如何利用 BFGF 調控 MSC 定向分化一直是研究熱點。本實驗通過病毒轉染方法，將外源性 bFGF 基因導入MSC,免疫組化染色結果發現，轉染細胞能夠成功表達 bFGF,并且其陽性主要位于細胞漿，Western-Blot 分析正式轉染細胞樣本能夠特異性表達 bFGF,而正常組和陰性組則未見 bFGF 特異性條帶。

綜上所述，采用病毒將bFGF基因轉染MSC中，具有操作相對簡單，目的基因遺傳穩定的特點。

參考文獻

[1] 鄭有華，張志光，蘇凱，等 . 體外培養條件下人骨髓間充質干細胞堿性成纖維細胞生長因子基因的轉染與鑒定 [J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010,14（19）：3507-3512.

[2] 鄭彬，孫峰，趙戈 . 堿性成纖維細胞生長因子基因轉染對鼠胎肝干細胞培養的優化作用 [J]. 中華移植雜志（電子版），2013,7（2）：89-93.