神經干細胞\\( neural stem cells,NSCs\\) 是分布于神經系統內的具有自我復制、增殖能力和多向分化潛能的細胞群,能分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等,是替代損傷神經細胞的潛在內生性資源。近年來,Bennett等在室周器官\\( circum-ventriculer organs,CVOs\\) 發現了神經干細胞,穹窿下器\\( Subfornical organ,SFO\\) 作為一個較大的室周器官,缺乏血腦屏障,很多大分子都可以通過,是腦神經再生和修復的重要位點之一。本研究利用免疫組化及免疫熒光雙標法,分別對 SAMP8 小鼠穹窿下器中溴脫氧尿嘧啶核苷\\( bromodeoxyuridine,Br-dU\\) 、性別決定基因高遷移率組蛋白\\( sex determiningregion Y\\) ,SOX2 以及巢蛋白\\( Nestin\\) 陽性細胞分布進行觀察。

材料和方法

1、 材料

SMP8 小鼠 20 只,8 月齡,體重 18 ~ 22 g,雌雄不限,均為二級實驗動物,由天津中醫學院第一附屬醫院實驗動物中心提供\\( 清潔級,合格證號: W-J 津實動質 M 準字第 006 號\\) 。

2、 方法

2. 1 分組 隨機分為四組,每組 5 只。一組按每只50 ㎎ / ㎏溶于 0. 3 ml 生理鹽水的劑量,腹腔注射 Br-dU\\( 美國 SIGMA 公司\\) ,連續五天給藥,每天兩次,間隔 8 h,第六天進行 BrdU 免疫組織化學染色。另外三組,分別用于 SOX2、Nestin 免疫組化染色及Nestin / SOX2 免疫熒光雙標染色。

2. 2 實驗流程

2. 2. 1 麻醉動物 開胸經主動脈灌注 4% 多聚甲醛磷酸緩沖液\\( 0. 1 mol/L,pH 7. 2\\) ,灌注完畢,取出整腦放入 4%多聚甲醛后固定過夜。用于免疫組化的標本,梯度酒精脫水、浸蠟、包埋,Leika 切片機連續切片,切片厚度 5 μm,并于顯微鏡下確定位置,分別用于 BrdU、Nestin 和 SOX2 免疫組化染色; 用于免疫熒光雙標的標本,依次 15%、30% 蔗糖溶液組織脫水,Leika 切片機連續冰凍切片,切片厚度 10 μm,顯微鏡下確定位置,然后進行 SOX2/Nestin 免疫熒光雙標染色。

2. 2. 2 免疫組織化學染色 \\( 1\\) BrdU 免疫組織化學染色: 石蠟切片常規脫蠟至水,50% 甲酰胺抗原修復液中微波修復 20 min,冷卻后,2 × SSC 沖洗 3 min× 2 次,0. 3% Trition 室溫下 15 min,2 mol / L 的鹽酸中室溫下 30 min,0. 1 mol/L 的硼酸緩沖液 5 min,0. 05% 胰蛋白酶 37℃ 下消化 20 min。10% H2O2封閉內源性過氧化物酶 10 min,10% 山羊血清 37℃下封閉 30 min。加入一抗,小鼠抗 BrdU 單克隆抗體\\( 美國 SIGMA 公司\\) \\( 1∶ 100 稀釋\\) ,4℃冰箱孵育過夜。生物素標記山羊抗小鼠 IgG,37℃溫箱濕盒內孵育 30 min,辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,37℃溫箱濕盒內孵育30 min。DAB 顯色,蘇木精溶液復染,常規酒精脫水、透明、封片,Olympus BX-UCB 顯微照相系統觀察攝片。以上步驟除血清封閉后直接一抗外,其余各步間用 0. 01 mol/LPBS\\( pH 7. 2 ~7. 4\\) 沖洗 5 min × 3 次。DAB 顯色,蘇木精溶液復染,常規酒精脫水、透明、封片,Olympus BX-UCB 顯微照相系統觀察攝片。同時設陰性對照: 一抗加0. 01 mol/LPBS\\( pH 7. 2 ~ 7. 4\\) ,其他步驟同前; 且以側腦室室下區作為陽性對照; \\( 2\\) Nestin 免疫組織化學染色:

石蠟切片常規脫蠟至水,檸檬酸緩沖液中微波修復20 min,冷卻后,10% H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min,10% 山羊血清封閉 37℃ 下封閉 30 min。加入一抗,單克隆小鼠抗 Nestin 抗體\\( 美國 SIGMA 公司\\) \\( 1∶ 50 稀釋\\) ,剩余操作方法同 BrdU 免疫組化染色; \\( 3\\) SOX2 免疫組織化學染色: 除一抗為多克隆山羊抗 SOX2 抗體\\( 美國 SIGMA 公司\\) \\( 1∶ 700 稀釋\\) 外,其他操作方法同 Nestin 免疫組化染色。

2. 2. 3 免疫熒光雙標染色 冰凍切片依次浸入0. 01 mol / L PBS\\( pH 7. 2 ~ 7. 4\\) 10 min、0. 3% TritonX-100 中 15 min,然后 10% 山羊血清 37℃ 下封閉 30min。加入一抗,鼠抗 Nestin 單克隆抗體 \\( 1 ∶ 50 稀釋\\) 及山羊抗 SOX2 多克隆抗體\\( 1∶ 500 稀釋\\) ,4℃冰箱孵育過夜。避光加入二抗: FITC 標記雞抗小鼠IgG 熒光抗體\\( 1 ∶ 50\\) 稀釋,羅丹明兔抗山羊熒光抗體\\( 1∶ 500 稀釋\\) ,37℃ 溫箱濕盒內孵育 2 h,室溫孵育 30 min。以上步驟除血清封閉后直接一抗外,其余各步間用 0. 01 mol/L PBS\\( pH 7. 2 ~ 7. 4\\) 沖洗 5min × 3 次,加入熒光二抗后要避光沖洗。50% 甘油封固,Olympus BX-UCB 顯微照相系統觀察攝片。

2. 3 陽性細胞計數 BrdU 陽性表達細胞的細胞核呈棕褐色,陰性細胞細胞核為藍色。SOX2 陽性細胞的細胞核呈棕褐色,陰性細胞細胞核為藍色。Nestin 陽性細胞的細胞漿為棕褐色,陰性細胞的胞漿無染色。

結果

1 BrdU、SOX2 及 Nestin 陽性細胞在穹窿下器的分布1. 1 BrdU 組織化學染色 在 SMP8 小鼠穹窿下器連續切片上,BrdU 陽性標記細胞的胞核呈棕褐色或棕黑色,著色不均勻,深淺不一。陽性標記細胞有的散在分布,有的成對分布,細胞核較小,有的呈橢圓形,有的形狀不規則\\( Fig. 1A\\) 。

1. 2 SOX2 組織化學染色 SOX2 陽性細胞的胞核染色深淺不一,呈棕色或棕褐色,在室管膜區和大血管周圍分布密集,其他部位散在分布。高倍鏡下可見陽性細胞胞核多呈圓形或橢圓形,細胞核長 2. 5~ 5. 5 μm,寬 1. 8 ~ 4. 0 μm\\( Fig. 1B\\)。

1. 3 Nestin 組織化學染色 Nestin 陽性表達細胞的胞漿為棕色或棕褐色,大小不一,有多個數目不等的分支,細長的突起相互交織,呈絮狀或絲狀,在室管膜下區分布密集,背側區分布較少,在兩側大血管周圍呈放射狀分布。高倍鏡下可見到粗大的陽性顆粒,放射絲長11 ~45 μm,寬0.6 ~1.5 μm\\( Fig.1C\\) 。

2 SOX2、Nestin 陽性標記細胞在穹窿下器的分布SOX2 陽性細胞胞核為紅色,在室管膜區密集表達,其他部位散在分布,胞核大小不一,形狀不等,在室管膜區排列整齊,胞核長 1 ~5 μm,寬 1 ~3. 5 μm\\( Fig. 2A\\) 。Nestin 陽性表達細胞為綠色,呈絲絮狀或云片狀分布,彼此交織,絲狀結構長 15 ~ 35 μm,在室管膜下區和中央區分布密集,聯合成片狀\\( Fig. 2B\\) 。穹窿下器內可見散在的 SOX2/Nestin 雙陽性細胞\\( Fig. 2C\\) 。

討 論

阿爾茨海默病\\( Alzheimer disease,AD\\) ,是伴隨有進行性的認知功能障礙和記憶能力損害的一種老年人常見的中樞神經系統退行性疾病,其重要的病理改變之一就是大量神經元的死亡,因此以神經生發為基礎的診療方法診治 AD 已成為研究的熱點?？焖倮匣V呆模型小鼠 SAMP8 是目前公認的理想的自然衰老癡呆模型,廣泛應用于 AD 的研究。本研究通過對 SAMP8 小鼠穹窿下器中神經干細胞陽性標記物的表達和分布進行觀察,來進一步了解早期 AD 患者腦內神經干細胞/祖細胞的分布規律。

神經干細胞是 Reynolds 等從成年小鼠紋狀體分離出的能在體外不斷分裂增殖并具有多種分化潛能的細胞群,目前有研究發現,哺乳動物的嗅球、海馬、側腦室的腦室區、室下區等均發現有神經干細胞存在,在適宜的條件下,神經干細胞可以自我增殖和多向分化,為研究及治療中樞神經系統疾病提供了新的途徑。神經干細胞/祖細胞的檢測特異性標記物常用的有 BrdU、SOX2 及 Nestin 等。BrdU 是一種胸腺嘧啶核苷的衍生物,在細胞有絲分裂的 S 期,能代替胸腺嘧啶摻入到細胞合成的 DNA 中,成為一種細胞增殖的標志。本研究通過給 SAMP8 小鼠連續5 d 腹腔注射 BrdU,在 SFO 內發現有 BrdU 陽性細胞,這些細胞成對或散在分布,這說明 SAMP8 小鼠穹窿下器存在有可以增殖的細胞,可能就是具有增殖、分化功能的神經干細胞/祖細胞。SOX2 是一種轉錄因子,表達于細胞核,能促進神經干細胞的轉錄,參與神經干細胞的維持。SFO 內 SOX2 陽性表達進一步提示了 SFO 可能存在有神經干細胞/祖細胞。Lori Bennett 等在成年大鼠側腦室室下區、終板血管器、海馬齒狀回、最后區等部位發現了SOX2 的陽性細胞,我室李力等在成年大鼠的室周器官之一最后區也發現了 Nestin 及 SOX2 陽性細胞,這支持了我們的推斷與發現。同時,SOX2 陽性細胞在室管膜區和大血管周圍分布密集,說明該處的細胞處于活躍期,因 SOX2 在許多正常組織細胞中都可以陽性表達,SOX2 陽性的細胞尚不能明確為神經干細胞/祖細胞。

我們進一步研究發現,在 SAMP8 小鼠穹窿下器內 Nestin 也有明顯陽性表達。Nestin 屬于Ⅵ型中間絲纖維蛋白,是主要細胞骨架蛋白,存在于神經上皮的干細胞,在神經細胞形成期開始高表達,在神經細胞遷移和分化后逐漸消失,是應用最早也是應用最廣泛的神經干細胞標志物之一。SAMP8 小鼠穹窿下器 Nestin 陽性表達進一步說明該室周器官可能存在神經干細胞/祖細胞。Nestin 陽性細胞在室管膜下區分布密集,說明該區的神經生發功能可能比周圍組織旺盛,與我們 SOX2 免疫組化研究結果一致。

同時我們的結果表明,Nestin 的表達低于 SOX2 的表達,提示部分 SOX2 陽性細胞可能不是神經干細胞/祖細胞。免疫熒光雙標染色中穹窿下器內存在SOX2 / Nestin 雙陽性表達細胞,進一步提示 SAMP8小鼠穹窿下器存在神經干細胞/祖細胞的可能性。

SFO 是一體積較大的室周器官,具有濃密而復雜的窗性毛細血管,缺乏血-腦屏障,并且處于腦-腦脊液界面上,是腦的開窗,是神經系統與免疫系統之間信息交流的通道,極易受到腦內環境改變的影響。這種獨特的組織學結構,必然導致此處為血液中有害物質侵入腦組織的位點。因此,穹隆下器必然存在著強大的修復功能,同時意味著神經干細胞在腦損傷時將會因微環境的改變而出現大量的增生、分化和遷移。因此我們認為,研究 SAMP8 小鼠穹隆下器神經干細胞/祖細胞將為進一步探討 AD早期的病理改變和診治提供相應的依據。