引言 Introduction
功能矯形治療是口腔正畸學中矯治患者下頜發育不足、后縮畸形的主要方法。顳下頜關節是人體關節中能保持終生改建的惟一關節，而髁狀突軟骨作為下頜骨的主要生長中心，對矯形力的反應直接而又敏感，是臨床功能矯形治療的主要功能區域，同時也是功能矯正器治療下頜后縮畸形的生物學理論基礎。多種因素可以誘發髁突改建如創傷、增齡性變化、顳下頜關節盤移位等，同時也是功能矯正器治療下頜后縮畸形的生物學理論基礎。是在使用功能矯正器對下頜后縮畸形的臨床矯正中，下頜向前移位，牽拉顳下頜關節韌帶，將應力作用于顳下頜關節，髁突軟骨在所承受之力的不斷作用下，發生相應的改建，髁狀突在功能矯形下獲得的垂直方向和水平方向的生長對于下頜后縮的改善起到有效而且持久的作用。Chen等研究中改變應力加載模式能對髁狀突軟骨產生不同的生長刺激，髁狀突軟骨內各種生長因子水平發生不同變化。Ng等研究中，重復的機械力刺激可以增加髁狀突軟骨中Ihh因子表達，而Ihh信號傳導通路在軟骨骨化成熟過程中起到關鍵作用。但是由于在體內實驗過程中，細胞力學的功能研究因其所處生理環境的復雜性、刺激因素傳導的不定向性，應力刺激對髁狀突軟骨細胞的直接影響需要進一步實驗研究。
髁狀突軟骨細胞是下頜骨生長、髁狀突改建及創傷后修復的主要細胞，功能負荷改變誘導組織中的間充質細胞增殖并分化為成軟骨細胞，再繼續分化為成熟的軟骨細胞，形成軟骨組織。髁突軟骨通過自分泌和旁分泌形式產生的細胞因子，形成復雜的代謝調控分子網絡，各種細胞因子之間相互拮抗或協同作用，調節酶及其抑制劑的活性，共同對軟骨的代謝進行調控。在促進髁突軟骨生長改進的應力作用下，促進細胞生長和基質形成的細胞因子表達增強；在異常應力的作用下，抑制細胞生長、促進基質降解的細胞因子表達增強。正畸治療下頜后縮畸形中，功能矯治器通對髁突施加一定的張應力刺激，引導其相應的生長因子調節下頜髁突生長來矯治下頜骨發育不足。
為了對髁狀突軟骨細胞在張應力下的反應做進一步探討，文章采用應力加載裝置對體外培養的髁狀突軟骨細胞施加一定的張應力，分析其生長改變，進一步闡述功能性矯正器對于下頜后縮的病例的矯正機制。
1 材料和方法 Materials and methods
設計：細胞學體外實驗。
時間及地點：于2012年1月至2013年12月在青島大學附屬醫院中心實驗室完成。
材料：
實驗動物：健康2周齡新西蘭白兔1只，雌雄不限，購 自 山 東 魯 抗 醫 療 公 司 ， 動 物 許 可 證 號 ： slxk-lu-20100109 。 實 驗 過 程 中 對 動 物 的 處 置 符 合 2009 年《Ethical issues in animal experimentation》相關動物倫理學標準的條例。
實驗設備：多通道細胞牽張應力加載系統由通訊作者袁曉博士與哈爾濱工業大學共同研制，應用Flexcell公司生產的BF-300lU BioFlex彈性膜6孔培養板作為細胞培養單元，動力加載單元使用VCA5038B型微型真空泵，并采用C8051f410單片機作為控制核心，通過編制相應的單片機程序，從而實現多通道細胞牽張應力的檢測與控制，根據對多通道細胞牽張應力控制實驗系統的設計要求，系統壓檢測范圍：0-25 kPa；可以提供0-20%的形變率，應變頻率在0-0.5 Hz內可調?！颈怼?br>
方法：
細胞培養：選取2周新西蘭白兔，麻醉后局部消毒取髁狀突軟骨，用PBS充分漂洗3次，將軟骨用手術剪剪至1 mm3大小，PBS沖洗2次。加0.25%胰蛋白酶大約3 mL至培養板中消化軟骨組織，5-10 min震蕩混勾1次，消化30 min后加入含血清的培養基終止消化，離心5 min\\(1 000 r/min\\)，將上清液吸去之后再向其中加入0.2%Ⅱ型膠原酶約2 mL，用移液管將沉淀吹散，放置于細胞培養箱中消化60 min，離心5 min\\(1 000 r/min\\)，得到沉降細胞，然后將含體積分數10%血清的細胞培養基加入管里后吹打均勻，調整細胞濃度為1×105，在新的培養皿中開始培養。
置于37 ℃恒溫，體積分數5%CO2，飽和濕度培養箱內培養。對通過以上培養技術得到的髁狀突軟骨細胞進行體外鑒定\\(甲苯胺藍染色\\)，并通過細胞形態觀察、細胞生長曲線描記、計算細胞倍增時間等對所培養細胞的生物學特性進行研究。
應力加載裝置：多通道細胞應力加載裝置采用1個真空泵抽吸由特制彈性硅膠膜制成的培養皿底部，形成負壓使培養皿底部產生拉伸變形，從而使附底生長的細胞受機械牽張，細胞所受力值大小以培養皿底部硅膠膜拉伸形變率\\(%\\)表示，形變率越大，表示細胞所受張力越大。
周期性張應力加載：在細胞培養至第3代時，調整細胞濃度為2×108L-1，并使之同步化生長后轉移至6孔BioFlex 特制細胞培養皿中繼續培養48 h待用。將待測細胞置于多通道細胞應力加載系統內，施加10%形變率、6循環/min的周期性張應力，每一循環包括3 s拉伸/3 s松弛；設置相應的不加力對照組。分別在0，1，6，12和24 h時收集細胞，檢測細胞的增殖情況。
流式細胞術測定髁狀突軟骨細胞增殖活性的變化：
加載應力完畢后，立刻收集髁狀突軟骨細胞于15 mL離心管中，同時收集相應對照組細胞。置于離心機內1 000 r/min離心5 min，棄上清，然后加入預冷的PBS 5 mL，反復吹打，再以1 000 r/min 離心5 min，棄上清，反復沖洗3次，用4 ℃體積分數75%乙醇2 mL固定髁狀突軟骨細胞，將制備好的髁狀突軟骨細胞懸液置于4 ℃冰箱過夜。上流式細胞儀檢測前，將固定好的細胞懸液，以1 500 r /min 離心5 min，棄上清，加入DNA-Prep LPR固定液100 μL，混勻10 s，再加入DNA-Prep Stain染料1 mL，混勻后室溫避光15 min，上機檢測S期細胞比率。
MTT法檢測應力加載對髁狀突軟骨細胞增殖的影響：在收集細胞前4 h每孔加入5 g/L的MTT 200 μL，各組取5孔細胞。
加力結束時，吸除各孔內液體，每孔再加入DMSO1.5 mL，搖床振蕩至染色顆粒完全溶解，使用加樣槍吸取液體至96孔板，每孔200 μL，以不含細胞的無血清RPMI-1640培養液作為空白調零孔，上全自動酶標儀，492 nm測定吸光度值\\(A\\)。
主要觀察指標：檢測S期細胞比率和髁狀突軟骨細胞增殖A值，定量檢測加載應力后細胞出現的變化。
統計學分析：本文作者應用SPSS 10.0軟件對實驗獲得的S期細胞比率和A值數據進行采用單因素方差分析，計量資料以x_±s表示，P < 0.05為差異有顯著性意義。
2 結果 Results
2.1 兔髁狀突軟骨細胞的生長狀態 原代培養的髁狀突軟骨細胞24 h內可完全貼壁，細胞形態不規則，三角形、多角形均存在。原代培養的軟骨細胞7 d可鋪滿整個培養瓶底，形成單層，軟骨細胞在部分區域簇集成團，呈集落樣生長。傳代培養的軟骨細胞一般36 h內可完全貼壁，一般5 d可形成單層。隨傳代次數增加，細胞中梭形細胞增多，軟骨細胞分泌和增殖能力下降，傳代周期延長\\(圖1A，B\\)?！緢D1.略】
2.2 兔髁狀突軟骨細胞的甲苯胺藍染色結果 原代培養的髁狀突軟骨細胞培養7 d后，甲苯胺藍染色見單層生長區域的細胞正染成淺藍色，有二至三個核仁，核仁呈深藍色，集落樣生長和多層生長區的中心部位細胞及細胞外基質異染成紫紅色，細胞核正染成深藍色，而其他邊緣部位異染不及中心區域\\(圖1C\\)。
2.3 兔髁狀突軟骨細胞的透射電鏡觀察結果 可見培養的軟骨細胞結構正常細胞核為球形，橢圓形，核形態不規則，核仁邊集，常染色質明顯，可見核小體，細胞內有大量粗面內質網，線粒體及分泌小泡\\(圖2A\\)。
2.4 兔髁狀突軟骨細胞S期細胞比率 流式細胞術結果顯示，10%形變率、6循環/min的周期性牽張力加載于細胞6 h和12 h后，細胞S期細胞比率開始增加，差異有顯著性意義\\(P < 0.05\\)；應力加載24 h后，細胞S期細胞比率增加為實驗時間內最高值，差異有顯著性意義\\(P < 0.01\\)。隨著應力加載時間的延長，加力組的S期細胞比率出現逐漸增高的變化，提示10%形變率、6循環/min的周期性牽張力在24 h內能夠促進髁狀突軟骨細胞的增殖活性\\(表1\\)?！颈?】
2.5 MTT染色結果 在10%形變率、頻率6循環/min的周期性張應力作用下，髁狀突軟骨細胞在加力1，6，12和24 h，與相應對照組比較均有細胞數量上的增加，其中加力24 h時細胞數量增加明顯，與對照組比較差異有顯著性意義\\(P < 0.01\\)，見表2?！颈?】
MTT染色結果顯示，髁狀突軟骨細胞內形成藍紫色結晶，加力1，6和12 h組細胞內呈現藍紫色顆粒狀物，結晶物較少；加力組在24 h時間點，細胞內呈現大量松枝狀的藍紫色結晶物，細胞增殖活性增強\\(圖2B，C\\)?！緢D2.略】
3 討論 Discussion
在臨床對下頜后縮病例矯正時，常采用功能矯正器，如Activator等對下頜生長進行刺激，促進下頜髁狀突軟骨區增生改建。通過矯正器持續的對下頜施加前伸力，顳下頜關節韌帶對髁狀突軟骨牽張加力，改變軟骨內細胞的受力環境，通過一系列細胞因子的調節，促進軟骨區細胞分化、增生、改建，進而形成新的骨組織，促進下頜升枝在長度和高度方向的增加。Pancherz等曾用頭影測量技術分析了98例經Herbst治療的Ⅱ類患者，經六至七個月的治療，有效的髁狀突生長為水平向后，增長量是對照組的3倍，髁狀突的生長引起頦部向前旋轉，這一改變是對照組的5倍。
Ruf等利用MRI技術，觀察治療前后髁狀突，關節窩的改建過程，發現在髁狀突后上區有一信號增強的清晰帶，說明該區細胞增生活躍，有新的軟骨組織形成。Ng、Ma、Thieme等在各自動物實驗中，通過對經功能矯正器治療的動物進行解剖，發現在髁狀突軟骨中細胞細胞各種促生長因子表達增加，細胞分化明顯，增生活躍。體內實驗提示功能矯正與髁突軟骨增生之間存在一定的作用關系，但機械力學與細胞生長調控之間的轉換機制仍處于研究之中。將作用力直接加載至細胞，觀察細胞生長變化成為現在研究機械力學與細胞生長調控之間的轉換機制的有效方法。
多通道細胞應力加載系統符合體外細胞應力加載的要求，操作方便，性能可靠，可長時間穩定運行，已在多種細胞體外加力實驗中得到應用。本實驗中應用多通道細胞應力加載系統模擬髁狀突軟骨細胞在體內受到功能矯正器作用力的狀態，隨下頜的前伸后退產生加力、松弛的循環。
髁狀突軟骨細胞通過對應力的感應，激活細胞復雜的信號傳導通路，如Ihh-PTHrP信號傳導通路、骨形態發生蛋白信號等，使得細胞代謝活躍，促進了細胞的增殖。通過流式細胞術對細胞周期的分布狀態進行分析以及應用MTT法檢測活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶對細胞增殖進行定量研究均顯示周期性的張應力對于髁狀突軟骨細胞增殖具有明顯的促進作用，加力組與對照組在6 h后差異均有顯著性意義。
本實驗結果顯示周期性應力可在24 h內不斷促進髁狀突軟骨細胞增殖，在24 h達到試驗時間內的最大值，與白明海等利用持續張應力刺激軟骨細胞得到的結論：在10 h達到增殖最高峰，12 h開始下降有所不同。因加力方式不同造成的結論不同說明周期性的張應力更適合于髁狀突軟骨細胞生長，能夠更加有效的改善下頜生長，促進下頜后縮矯正。實驗結果對髁突軟骨適應性改建的分子機制提供一定的實驗參考，但具體改建機制及信號傳導機制尚待深入研究。
