一 、引言.
雄性生殖干細胞具有自我復制和分化成精子的能力,是動物體內唯一能進行遺傳信息傳遞的干細胞。雄性生殖干細胞技術的發展和應用,將為克隆動物、瀕危動物保種、轉基因動物的生產、治療雄性不育及一些人類遺傳疾病的基因治療提供新的機遇與途徑。研究表明,雄性生殖干細胞可以誘導分化成特定類型的細胞,在再生醫學治療領域具有廣闊的應用前景,是繼ES細胞、滬S細胞之后的另一種細胞來源。
目前,關于哺乳動物雄性生殖干細胞的體外增殖與分化的大量研究主要集中在小鼠和人上,在其他動物的研究很少。本研究以新生犢牛翠丸為實驗對象,探討新生牛皋丸雄性生殖干細胞體外增殖與分化的相關影響因素和技術體系,以期為建立穩定、高效的家畜雄性生殖干細胞體外增殖與分化體系提供理論和實踐依據。
材料與方法新生牛翠丸組織采用兩步酶法消化,差速貼壁后進行培養,并添加GDN下和UF,形成集落后檢測ocT-4、soxZ、Nanog、PGPg.5、GFRal、DAzL等標志基因。雄性生殖干細胞原代培養形成的集落消化,形成類胚體分化和直接誘導分化,檢測單倍體的標志基因PRM一2和TP一l的表達。
二、結果.
雄性生殖干細胞與支持細胞共培養可形成葡萄串狀集落和Es樣集落,1oongmL一,的GDNF能顯著促進雄性生殖干細胞以葡萄串狀集落形式增殖,looolumL一’的uF能顯著促進雄性生殖干細胞以ES樣集落形式增殖。
雄性生殖干細胞集落KAP、OC科染色呈陽性,葡萄串狀集落表達多能性的標志基因OC下4、SOXZ和精子發生的標志基因DaZI,ES樣集落表達多能性的標志基因OCT-4、SOXZ、Nanog,不表達精子發生的標志基因。
雄性生殖干細胞集落在支持細胞飼養層進行傳代培養,2%血清、100ngmL’,GDNF的培養液培養葡萄串狀集效果較好,10%血清、1o00lumL一’LIF的培養液培養Es樣集落效果較好。
雄性生殖干細胞集落消化吹打成單細胞懸液,進行懸滴培養能形成類胚體,類胚體貼壁后分化培養,10天后觀察到州叭P一2呈陽性表達的神經樣細胞。
分化培養卜2周后,能觀察到胞質間橋相連的鏈狀克隆和分化的類精母細胞、類圓形精細胞,培養4一5周后,能觀察到精子樣細胞,精子樣細胞表達單倍體基因PRM一2和TPI。
三、結論.
利用低血清培養液并添加生長因子進行共培養,初步建立了新生牛翠丸雄性生殖干細胞體外增殖體系。將雄性生殖干細胞原代培養形成的串狀克隆傳代到支持細胞飼養層上進行分化,初步建立了新生牛翠丸雄性生殖干細胞體外分化體系。
