藏獒（ＴｉｂｅｔａｎＭａｓｔｉｆｆ）屬食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）犬科（Ｃａｎｉｄａｅ），是原產于青藏高原地區的古老犬種，也是中國唯一的一個大型犬種，屬于國家二級保護動物。由于近幾十年來藏獒被大量販運到內地省份，甚至國外，加上當地生存環境惡化，青海、西藏等原產地優良藏獒數量劇減，正面臨著種群資源流失的危險（郭憲等，２００８）。國內約２０年前才開始了對藏獒的認識與研究，主要研究集中在藏獒疾病防治、飼養管理、繁殖培育、品種鑒別等方面，少量研究涉及藏獒血液生理生化特征（李動等，２０００）、種群遺傳多樣性（Ｌｉ等，２００８）、選配選育（崔泰保等，２００９）、精液保存（鄭筱峰等，２０１０）等方面，而細胞、分子方面的研究較少。國外有研究報道應用動物體細胞克隆技術生產克隆狗獲得成功（Ｊａｎｇ等，２００８），國內尚未開展此項研究的報道。體細胞克隆技術已成為保護珍稀動物資源的新方法。目前在國內已建立了大熊貓（張明等，２００６）、黑麂（方俊順等，２００７）、朱鹮（王金煥等，２０１２）等珍稀動物皮膚成纖維細胞系進行細胞生物學特性和遺傳資源保護研究。本研究利用組織塊法建立了２株藏獒皮膚成纖維細胞系，對其體外培養的培養條件、生長特性、冷凍復蘇、波形蛋白表達、細胞核型進行了研究，為藏獒體細胞克隆研究提供了供體細胞。
１材料與方法
１．１試 劑 及 儀 器 ＰＢＳ、ＤＭＥＭ、Ｄ／Ｆ－１２、ＴＣＭ１９９、胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉混和溶液、胎牛血清、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ均購自Ｇｉｂｃｏ公司；二甲亞砜購自Ａｍｅｒｉｓｃｏ公司；Ｇｉｅｍｓａ染料、臺盼藍染料均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。
臺式離心機購自Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司；二氧化碳培養箱購自三洋公司；超凈工作臺購自東聯哈爾公司；倒置熒光顯微鏡購自尼康公司。
１．２皮膚組織的獲取與處理 ２只３月齡藏獒（１公１母）經耳部剪毛、清洗和消毒后，剪取皮膚組織約０．５ｃｍ２，放入磷酸緩沖液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）溶液，４ ℃下２ｈ內運回實驗室。用ＰＢＳ溶液反復沖洗組織塊８～１０次，用手術刀片刮去組織表面毛根及部分表皮，用眼科剪刀去除軟骨，將皮膚組織剪成約１ｍｍ３小碎塊。組織塊經ＰＢＳ溶液反復洗滌４次，用細胞培養液（Ｄ／Ｆ－１２添加２０％胎牛血清、１００ＩＵ／ｍＬ青霉素、１００μｇ／ｍＬ鏈霉素、４０μｇ／ｍＬ表皮生長因子）離心洗滌３次，用１ｍＬ細胞培養液重新懸浮。
１．３細胞培養 為了增加組織塊貼壁能力，先用胎牛血清涂布Ｔ２５細胞培養瓶（Ｃｏｒｎｉｎｇ）底部，然后用吸管將組織塊轉移至細胞培養瓶，用牙科探針將組織塊擺放于瓶底部，每瓶５～８塊。將培養瓶倒置放入ＣＯ２培養箱培養２～４ｈ后，加入３ｍＬ細胞培養液翻轉培養瓶繼續培養，每３ｄ更換１次細胞培養液，觀察細胞生長情況。當細胞從組織塊周圍游離出來并向周圍成片生長時進行傳代，用ＰＢＳ溶液洗滌２次，用 牙 科 探 針 挑 取 組 織 塊，加 入２ ｍＬ０．２５％胰蛋白酶和０．０４％乙二胺四乙酸二鈉混和溶液于３７℃消化細胞３ｍｉｎ，加入２ｍＬ細胞培養液終止消化，于１０００ｒ／ｍｉｎ離心細胞，棄上清，用細胞培養液重新懸浮細胞，計數后以５×１０４／ｍＬ的密度接種于新培養瓶繼續培養。經過５～７ｄ生長后，細胞達到８５％～９０％匯合，再次按１∶３或１∶４比例進行傳代培養。
１．４細胞凍存與復蘇 生長中的細胞達到８５％～９０％匯合時可以進行細胞凍存，經ＰＢＳ洗滌，胰酶消化、離心后，在每一個Ｔ２５培養瓶細胞沉淀物中加１ｍＬ預冷至４ ℃的細胞凍存液 （Ｄ／Ｆ－１２添加１０％胎牛血清、１０％二甲亞砜），移到細胞凍存管（Ｃｏｒｎｉｎｇ），放入細胞凍存盒（Ｎａｌｇｅｎｅ）于４ ℃平衡０．５ｈ后，轉移到－８０℃低溫冰箱保存２４ｈ后，將細胞凍存管投入液氮保存。復蘇細胞時，將凍存管于３７℃水浴中快速搖動解凍細胞，移到１５ｍＬ離心管，加入９ｍＬ細胞培養液混勻，離心沉淀細胞，加入５ｍＬ細胞培養液重新懸浮細胞，移到Ｔ２５細胞培養 瓶 培 養，２４ｈ后 換 培 養 液 去 除 漂 浮 的 死 亡細胞。
１．５細胞生長曲線繪制 ?。财可L至８５％匯合的Ｆ４代細胞用胰酶－ＥＤＴＡ混合液消化，用細胞培養液將細胞稀釋至１×１０４／ｍＬ、３×１０４／ｍＬ和５×１０４／ｍＬ３種 密 度，分 別 加 入２４孔 細 胞 培 養 板（ＮＵＮＣ）孔中，每孔１ｍＬ，第１列加３孔，共加１０列。將培養板放入培養箱中，每２ｄ更換１次培養液。從第１列開始每天在固定時間取出培養板消化３個孔的細胞，稀釋后用血球計數板進行細胞計數，取其平均值，以天數作為橫坐標，以細胞數作為縱坐標，繪制細胞生長曲線?？捎靡韵鹿角蟮眉毎后w倍增時間（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ，ＰＤＴ）。式中，ｔ代表培養時間；Ｎ０代表首次計數獲得的細胞數；Ｎｔ代表培養ｔ時間后的細胞計數。
１．６細胞波形蛋白免疫熒光分析 參考Ｂｏｎｉｆａｃｉ－ｎｏ等（２００７）方法，稍作修改。將細胞懸液按每孔４ｍＬ的量加入預先放置蓋玻片（ＮＵＮＣ）的６孔板內，培養到細胞至５０％～７０％匯合。吸出培養基，每孔加入含２％甲醛的ＰＢＳ，室溫孵育１０ｍｉｎ，吸出甲醛，ＰＢＳ洗滌２次。在蓋玻片上，加２ｍＬ含１０％ＦＢＳ的ＰＢＳ，放置１０～２０ｍｉｎ。用含０．２％～０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００和１０％ ＦＢＳ的ＰＢＳ稀釋一抗（ｍｏｎｏ－ｃｌｏｎａｌａｎｔｉ－ｖｉｍｅｎｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｍｏｕｓｅ，１ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨＩｎｃ．）于１．５ｍＬ離心管中，稀釋比例為１∶１０００。用高速離心機最大速度離心抗體稀釋液和對照組溶液，從沉淀物中吸出抗體溶液。加一抗２５μＬ，用鑷子取出蓋玻片，再將其置于２５μＬ的一抗溶液內，細胞面向下。室溫于濕盒內孵育１ｈ。取出蓋玻片，細胞面朝上，加入含１０％ ＦＢＳ的ＰＢＳ，放置５ｍｉｎ后吸出溶液，重復２次以上。用含０．２％～０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００和１０％ＦＢＳ的ＰＢＳ溶液稀釋二抗（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）－ｃｏｎ－ｊｕｇａｔｅｄａｆｆｉｎｉｐｕｒｅｇｏａｔａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），９．０ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－ＡＬＤＲＩＣＨＩｎｃ．），稀釋比例為１∶１００，混勻后離心除去沉淀。在蓋玻片上加一滴二抗２５μＬ，將蓋玻片置于二抗溶液內，蓋上培養皿蓋，避光存放，室溫孵育１ｈ。取出蓋玻片，細胞面朝上，放入培養板，加入含１０％ ＦＢＳ的ＰＢＳ，放置５ｍｉｎ，再吸出溶液；重復２次以上。滴加含０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００和１０μｇ／ｍＬＰＩ（ｐｒｏｄｉｐｉｕｍｉｏｄｉｄｅ）的ＰＢＳ孵育２ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗滌３次。用抗熒光淬滅封片劑（ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－ＧＴＭ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇ－ｈａｍＵＳＡ）封片后，在熒光顯微鏡下觀察。ＦＩＴＣ用４９２ｎｍ激發光，ＰＩ用５３５ｎｍ激發光。通過與對照組比較，確定非特異染色區域。
１．７細胞核型分析 參考Ｆｒｅｓｈｎｅｙ等（２００８）方法，稍作修改。將５ｍＬＦ５代細胞懸液以３×１０４／ｍＬ密度接種在Ｔ２５培養瓶中培養３～５ｄ后，加入秋水仙素使其終濃度為０．３μｇ／ｍＬ，作用４ｈ。用胰酶消化細胞，離心后，加入０．０７５ｍｏｌ／ＬＫＣＩ混懸細胞，３７ ℃靜置１３ｍｉｎ。加入冰冷的醋酸甲醇，混合后離心，棄上清，邊振蕩邊加入醋酸甲醇，冰上靜置１０ｍｉｎ。離心細胞，棄上清，加入０．１～０．２ｍＬ醋酸甲 醇，振 蕩 混 懸 細 胞。用 吸 管 將 細 胞 懸 液 從３０ｃｍ處滴到涼的玻片上，傾斜玻片讓液滴鋪展開?；鹧娓稍锊Ｆ?，用相差顯微鏡觀察，如細胞均勻鋪展，制作更多的玻片。在玻片上加數滴純Ｇｉｅｍｓａ染液，染色４ｍｉｎ，流水沖洗，干燥。在玻片上滴加１滴二甲苯，蓋上蓋玻片，在油鏡下觀察分散良好的染色體并拍照。用Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ軟件剪切單個染色體，成對排列后，用尼康顯微鏡（ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＴｉ）圖像處理軟件（ＮＩＳ－ＥｌｅｍｅｎｔｓＢＲ３．００，ＳＰ１）進行染色體數據測量。
２結果與分析
２．１藏獒皮膚成纖維細胞體外培養生長情況及形態特征 用組織塊法建立了２株藏獒皮膚成纖維細胞系，組織塊經貼壁培養５～７ｄ，周圍可見梭形或鋪路石樣多邊形細胞游出并向四周生長，隨著培養時間延長至１２～１５ｄ，組織塊周圍出現大片細胞生長區，大多數組織塊周圍的細胞生長區以梭形細胞為主，少量細胞生長區呈現梭形細胞和多邊形細胞混合生長。組織塊培養１４～１６ｄ時進行傳代培養，傳代后細胞生長迅速，呈現柵欄狀或漩渦狀生長，于４～５ｄ生長至９０％匯合（圖１），需再次進行傳代培養。體外培養的藏獒皮膚成纖維細胞凍存和復蘇后，經臺 盼蘭染料排 除試驗測定，細胞存活率達８８．７％，可正常生長，形態和傳代時間未見明顯變化。體外培養的藏獒皮膚成纖維細胞經１５次傳代培養后，細胞生長速度明顯減慢，培養中大量細胞脫壁。
２．２細胞生長曲線特點 Ｆ４代藏獒皮膚成纖維細胞生長曲線見圖２。由圖２可知，體外培養細胞經過１ｄ的潛伏期后開始快速增殖，存在著明顯的對數生長期（３～７ｄ），約在第７天達到平臺期，平臺期以后逐漸進入衰退期。當以較低細胞密度（１×１０４／ｍＬ）接種培養時，潛伏期延長（１～３ｄ），對數生長期曲線較平緩，約在第９天達到平臺期。３組培養細胞達到平臺期時的細胞密度分別為４．５×１０５／ｍＬ、５．２×１０５／ｍＬ、８．６×１０５／ｍＬ。計算所得的ＰＤＴ分別為４６．１、３９．４、４８．５ｈ，屬于哺乳動物體細胞正常ＰＤＴ范圍。
２．３藏獒體細胞波形蛋白免疫熒光分析結果 用波形蛋白單克隆抗體進行免疫熒光染色，與對照相比呈現明顯的陽性結果，被綠色熒光標記的波形蛋白主要分布在細胞核周圍區域（圖３）。２．４細胞核型分析 Ｆ５代藏獒體細胞正常的染色體核型比率為９１．４％。由圖４可知，藏獒染色體２ｎ＝７８，全部常染色體均為端著絲粒染色體，Ｘ染色體較大，為亞中著絲粒染色體，Ｙ染色體為端著絲粒染色體。
３討論
目前，國外已有報道成功地克隆了狗（Ｊａｎｇ等，２００８）和灰狼（Ｋｉｍ等，２００７），而國內尚未開展這方面的研究。已有報道進行了德國牧羊犬（寧小檬等，２０１２）、比格犬（鐘泉等，２０１０）等犬類成纖維細胞培養，但藏獒體細胞培養相關報道極少。本研究用組織塊培養法成功建立了２株藏獒成纖維細胞，這２株細胞生長良好、增殖能力強，體外傳代培養后冷凍保存了各代細胞４０多管（２ｍＬ凍存管），在細胞水平保存了藏獒遺傳資源，也為后期的藏獒體細胞核移植提供了供體細胞。
組織塊培養是常用的動物體細胞原代培養方法，由于避免了長時間酶消化對細胞表面的破壞作用，所以組織塊培養法能較好地保留來源組織的特征。供體細胞對體細胞核移植的生產效率有重要影響（Ｐｏｅｈｌａｎｄ等，２００７），本研究用組織塊法建立的藏獒成纖維細胞保持了較好的細胞活力，有利于提高藏獒體細胞核移植生產效率。體外培養的藏獒成纖維細胞生長特性及形態特點與已報道的犬類成纖維細胞相類似（寧小檬等，２０１２）。本研究利用多邊形上皮樣細胞胰酶消化需時較長和傳代后貼壁較慢的特點，通過控制胰酶消化時間，在傳代后１５ｍｉｎ從培養瓶吸去培養液并更換新培養液，經３～５次傳代處理得到了較純的梭形成纖維細胞群體。
體外分離培養的動物體細胞受到分離培養方法、培養環境等諸多因素的影響，隨著群體染色體非整倍性的改變其增殖能力變化較大。測定細胞生長曲線能較好地反映出細胞的增殖能力，依此也可評估細胞的健康狀況。本研究測定了藏獒成纖維細胞生長曲線，平臺期密度最高值達到８．６×１０５／ｍＬ，最短ＰＤＴ為３９．４ｈ，表明細胞增殖能力強、生長速度較快。波形蛋白（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）是細胞中一種重要的細胞骨架成分，在皮膚組織中波形蛋白在成纖維細胞大量表達，可作為分離培養的成纖維細胞鑒定標志之一（Ｘｕ等，２０１０）。對所建立的藏獒成纖維細胞進行了波形蛋白表達研究，證實藏獒細胞呈現波形蛋白表達陽性，結合細胞形態特征可初步判定細胞群體屬于成纖維細胞類型。
體外培養的動物體細胞與活體組織生活環境不同，隨著傳代次數的增加容易發生染色體變異。體細胞染色體的整倍性也關系到體細胞克隆胚胎和動物的發育能力（Ｊａｎｇ等，２００４）。對藏獒成纖維細胞進行了染色體整倍性研究，根據染色體整倍性狀況來判定其能否作為藏獒體細胞核移植研究的供體細胞。同時，藏獒染色體核型研究對青海地區藏獒的分類、進化和遺傳繁育有重要參考價值。以前的研究多是以外周血細胞為材料進行藏獒染色體核型分析，為了進一步研究青海地區藏獒體外培養細胞的染色體組型特征，試驗對所建立的Ｆ５代藏獒體細胞進行了細胞遺傳學分析。從統計數據顯示，Ｆ５代藏獒體細胞正常的染色體核型比率為９１．４％，出現了一定比例的非整倍性染色體組型和四倍體，有必要進行培養條件的優化來阻止其隨著傳代次數增加而發生較嚴重的染色體變異。染色體核型分析結果證實藏獒染色體２ｎ＝７８，全部常染色體均為端著絲粒染色體，Ｘ染色體較大，為亞中著絲粒染色體，Ｙ染色體為端著絲粒染色體，與已報道的用外周血細胞進行 的染色體核 型分析結果 相 一 致 （張 昱 等，２００３；張亞君等，２００９）。根據圖像軟件測量結果，對常染色體進行了排序，顯示了藏獒染色體組型的基本特征。然而，藏獒染色體標本中存在著一些不易觀測的微小染色體，用目前的方法進行準確配對存在著一定的困難，還需應用染色體顯帶、熒光標記染色體和分子探針技術進行進一步研究。
本研究建立了藏獒成纖維細胞株，冷凍保存了約４０多管（２ｍＬ凍存管）傳代細胞，對其體外培養條件、生長曲線、波形蛋白表達、染色體核型進行了研究。藏獒皮膚成纖維細胞系的建立，可以保存優秀藏獒種質資源，為以后開展藏獒分子生物學、細胞生物學研究提供了良好的材料，也為今后的藏獒體細胞克隆研究奠定了基礎。用所建立的藏獒成纖維細胞作為供體細胞、用藏狗去核卵細胞作為受體胞質進行藏獒體細胞核移植研究，將所生產的藏獒克隆胚胎移植到藏狗受體輸卵管中生產藏獒克隆后代，可以提高藏獒繁殖效率，快速擴繁優秀藏獒種群。這也是國內繼藏獒精液保存技術應用于藏獒繁殖之后建立的另一項重要的藏獒輔助生殖技術，該項技術將有力地推動藏獒繁殖生物技術的發展和應用。同時，本研究所建立的藏獒體細胞培養技術體系能為犬類體細胞培養和建系提供參考。
參 考 文 獻
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４張亞君，張惠萍．藏獒染色體核型分析［Ｊ］．青海畜牧獸醫雜志，２００９，３９（４）：１４～１５．
５張明，候蓉，鄭鴻培，等．大熊貓皮膚成纖維細胞在不同培養液中的生物學特性研究［Ｊ］．揚州大學學報（農業與生命科學版），２００６，２７（３）：３５～３９．
６張昱，袁寧，王文青，等．藏獒（ＴｉｂｅｔａｎＭａｓｔｉｆｆ）的核型研究［Ｊ］．青海醫學院學報，２００３，１８（４）：２２５～２２６．
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１１崔泰保，郭憲，鄢珣．河曲藏獒犬品種保護與選育研究［Ｊ］．家畜生態學報，２００９，３０（２）：２２～２５．
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