我們已報導了培養的哺乳動物細胞及其核在X線照射后電泳移動度\\(EPM\\)降低. EPM隨著時間而降低,以照后4小時降低最為明顯.小劑量照射,在照后保溫24小時,有些細胞的EPM即恢復到正常.EPM的改變能完全被低濃度的疏基阻斷劑、植物血凝素或刀豆素A所阻斷.
本研究應用紅細胞及其殘骸,因其有以下優點:\\(1\\)紅細胞缺核,殘骸既缺核又缺細胞漿,這樣可以研究細胞漿和細胞核兩個主要成份在輻射導致的EPM改變中的意義;\\(2\\)培養的哺乳動物細胞的EPM主要決定于唾液酸、硫酸軟骨索和透明質酸,而在紅細胞,唾液酸是僅有的帶負電荷的主要威分;\\(3\\)紅細胞易于大量得到.
材料和方法.
紅細胞是在實驗前由穿刺大鼠心臟取得.紅細胞殘骸的制備是先將紅郭胞在3℃低滲的巴比妥緩沖液中攪拌,溶解的紅細胞用低滲巴比妥緩沖液清洗三次,然后懸浮在等滲的PBS中以恢復膜形.
紅細胞是在實驗前由穿刺大鼠心臟取得.紅細胞殘骸的制備是先將紅郭胞在3℃低滲的巴比妥緩沖液中攪拌,溶解的紅細胞用低滲巴比妥緩沖液清洗三次,然后懸浮在等滲的PBS中以恢復膜形.
體外照射紅細胞及其殘骸,觀察100、250、5D0或3...倫照射后不同時間紅細胞及其殘骸的EPM.
單個細胞的EPM測定是用蔡氏細胞電泳裝置\\(ZeissCytopherometer\\).電泳移動度按以下公式計算.
結果.
一、X線照射后EPM隨時間的改變.
完整紅細胞照后EPM隨時間進行性地降低,以照后4小時為最明顯,到照后24小時恢復,但恢復的程度與照射劑量有關.小劑量照射恢復較好,3000淪照射未.見恢復.
紅細胞殘骸如同紅細胞一樣,照后4小時EPM降低,但以后不論照射劑量多大皆不恢復.結果說明,不論有無核或細胞漿,輻射都可使EPM降低,而恢復則必需有細胞漿.非照射的紅細胞在PBS中孵育24小時EPM可降低10%,而250或500倫照射的紅細胞在PBS中觀察不到EPM的恢復.
二、唾液酸含量.
用神經胺酶與紅細胞孵育以除去唾液酸,使紅細胞EPM降低60%.用透明質酸酶或軟骨素酶處理對EPM則無影響.在照后4小時EPM降低最明顯時測定紅細胞殘骸唾液酸含量,不論照射劑量多少,唾液酸含量都沒有改變,說明唾液酸含量與EPM降低無關.
三、溫度對EPM改變的影響.
紅細胞在3OCPBS中照射500倫,照后在不同的溫度條件下孵育4小時.EPM降低程度在22、3T'C范圍內與溫度的變化無關,在IOOC以下孵育EPM不發生改變.'
在10、20'C時EPM的降低與溫度間有明顯的依賴關系.非照射紅細胞在不同溫度的條件下孵育本身對EPM無任何影響.
四、離子強度對顯現輻射效應的影響用于側定EPM的磷酸緩沖液的離子強度對EPM值有影響.隨著離子強度的增加,EPM不斷降低.離子強度低于0.2x0.16了時,受照和對照的紅細胞EPM的降低值相同,隨著離子強度的增加,兩者EPM下降的程度則有差別,受照紅細胞較對照紅細胞EPM下降得明顯,離子強度在0.6x0.167以上時差別為最明顯.按照Debye-Huckel公式,從離子強度可以計算離子霧\\(I.natm.sphere\\)的厚度.隨著離子強度降低,離子霧厚度增加.
離子霧厚度=3.06\\(適用于水溶液\\)、\\(離子強度\\)'拭若用離子霧厚度作為近似地計算電動力學切變面\\(eleetrokinetiePlaneofshear\\),結果說明帶陰電荷的基團\\(即唾液酸\\)從0、了.5埃的周邊區錯位至9.7、17埃的深層區.
討論.
紅細胞及其殘骸的實驗結果說明,就紅細胞EPM的降低而言,細胞膜是X輻射的作用靶,細胞漿是照后EPM恢復的必要因素.
谷朧甘膚和ATP的加入可使EPM恢復,說明它們可能也參與恢復過程.但細胞膜對谷朧甘膚和ATP是不通透的,可能這些外源性物質的效應與其在細胞漿內的作用不同.
瑪紗即"和Bide報導了照射使細胞內谷朧甘膚損失,但隨后在37℃下孵育即能很快恢復,并與鉀含量恢復直關.Suther飛"nd和Pill發現紅細胞在有葡萄糖的條件下孵育時,膜琉基能重現,但紅細胞殘骸或無葡萄情時的紅細胞則不能恢復.作為照后紅細胞通透性改變的機理,Shapir.等提出胞膜發主了涉及琉基的構象改變.
照后EPM降低時唾液酸含量沒有改變說明,細胞膜發生了局部改變.早有報導,受照射的培養哺乳動物細胞不釋放唾液酸和硫酸軟骨素.本實驗EPM降低與溫度的依從關系也支持局部改變的設想.植物血凝素受體的局部改變和膜成分重排也顯示類似的溫度依賴關系.照射反應在15℃左左有明顯的改變是由于此時膜脂的流動性有變化.
EPM的降低能被SH一阻斷劑和血凝素完全抑制,是與本設想相一致的.
用不同離子強度磷酸緩沖液測定EPM所得的結果為荷電基團錯位提供了可靠的證據.普遍觀察到隨著離子強度的降低EPM增加.但是,從離子強度值難以確定電動力學的切變面的正確深度.荷陰電的糖是存在于雙層脂外的親水層中.假如我們設想離子自由地穿到親水層,離子霧的厚度能給出一個電動力學切變面的近似估計.照后離子強度在0.10D以上時EPM降低這一事實提示唾液酸從周邊區錯位到較深層.
