骨髓間充質干細胞是一類非造血干細胞，來源于中胚層，具有多分化潛能，具有自我更新能力，易于分離培養，體外增殖能力強的特點。骨髓間充質干細胞在體內發揮調節免疫，減輕炎癥反應，組織再生，損傷修復，維持內環境穩態的作用.

在進行自體移植方面具有安全，無致瘤性，無組織配型和免疫排斥的問題，因而成為組織工程與再生醫學研究的焦點。種子細胞是組織工程的關鍵因素之一。骨髓間充質干細胞可以分化為骨細胞，軟骨細胞，肌腱，肌肉細胞，成纖維細胞，脂肪細胞，肝細胞，甚至神經元細胞。為結締組織等相關疾病中的骨、軟骨、肌腱等的損傷修復提供了潛在的細胞來源，被認為是骨組織工程中有價值的種子細胞.hMSCs 的成骨定向誘導可為骨組織工程技術治療大段骨缺損提供種子細胞，滿足其在種子細胞數量和質量上的需要。實驗通過全骨髓培養法分離hMSCs,并用誘導分化培養液做定向誘導培養，觀察 hMSCs 向成骨細胞分化過程中的細胞形態學變化，進行成骨細胞生物學表型鑒定以探討 hMSCs 的培養方法、生長規律及向成骨細胞分化的條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 試劑及細胞

培養基 α-MEM,0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA,L-谷氨酰胺，青霉素/鏈霉素雙抗，胎牛血清（FBS），Trizol 裂解液購自公司；四氮唑藍（MTT），茜素紅 S,β-甘油磷酸鈉，地塞米松和維生素 C,蛋白質裂解液 RIPA 購自Sigma 公司；堿性磷酸酶活性檢測試劑盒，購自CellBiolabs公司；逆轉錄試劑盒購自Qiagen公司，引物由 Invitrogen 公司合成；抗體 RUNX2,BMPR2,GAPDH 購自 Cell Signaling 公司。人骨髓間充質成體干細胞第一代傳代細胞由Gene Therapy 提供。

1.1.2 成骨誘導培養基

基礎培養基（內含體積百分比為 16.5%的胎牛血清+α-MEM+1%青霉素/鏈霉素+2 mM L-谷氨酰胺），加入 20mM 的 β-甘油磷酸鈉，10nM 地塞米松，100μM 維生素 C 配制成成骨誘導培養基。

1.2 方法

1.2.1 數量為 1×的細胞接種于直徑為 10cm 的培養皿中，用含 16.5%FBS 的 α-MEM 培養液，于37℃，5%CO2,飽和濕度>95%的 CO2 培養箱中培養，3~4 天細胞達到 80%融合時用 0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA 消化傳代。根據實驗需要重新接種在合適培養瓶或培養皿中。6 孔板中用于鈣結節染色分析，96孔板中用于MTT實驗和堿性磷酸酶（ALP）檢測，10cm 直徑培養皿用于提取總 RNA 和蛋白質，分別用于 RT-PCR 和蛋白質印跡實驗。誘導分化培養組（實驗組）加入誘導分化培養液，基礎培養組（對照組）加入等量基礎培養液，每 3 天換液一次。

1.2.2 細胞觀察

倒置相差顯微鏡觀察體外培養細胞的生長、增殖、細胞形態變化及鈣鹽沉積。

1.2.3 細胞礦化作用檢測 用 4%甲醛固定細胞min,1×磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，1%飽和茜素紅染色 30min,觀察細胞的形態和染色結果。

1.2.4 堿性磷酸酶（ALP）活性測定 采用StemTAG 堿性磷酸酶活性檢測試劑盒測定ALP活性。

等描述的方法為先將細胞用預冷的 1×PBS 沖洗，加入試劑盒中的細胞裂解液，4℃孵育 10min,轉入離心管內 12 000 轉/min 離心 10min,定量蛋白濃度，取 50μl 裂解液轉入 96 孔板，加入 50μStemTAG 堿性磷酸酶活性測定底物，37℃孵育20min,加入 50μl 終止液?；靹?30s,以波長檢測吸光度 A 值。

1.2.5 骨鈣素（OCN）的測定

將細胞接種于 6 孔板內，誘導期末即（第 1,3,5,7,9,13,17,21 天）時，用 PBS 洗凈孔內的培養液，加裂解細胞，按試劑盒的說明書進行操作，抽提總RNA.引物序列 OCN:上游引物 5'GCA AAG-3',下游引物 5' CAG-3';β-actin:上游引物 5'GAG CTG CG-3',下游引物 5'ACA TGG-3'.β-actin 作為內參，設置無模板的陰性對照。使用 Qiagen 試劑盒進行逆轉錄 cDNA 及RT-PCR,RT-PCR 反應在（Bio-Rad）測定儀中進行。預變性 95℃ 5mn,PCR 循環條件為： 95 ℃，30 s;65 ℃，30 s;72 ℃，2 min,共個循環，試驗中 Ct 值進行三次重復檢測。

1.2.6 蛋白質印跡實驗

將 6-孔板中培養不同時間點的誘導成骨細胞組和對照組細胞，用預冷的PBS 沖洗三遍，加入細胞裂解液，超聲處理 1min,10 000x g 離心 5min.裂解的上清液進行蛋白質濃度定量。蛋白質印跡實驗按照 Cell signaling 公司說明書，6%~12%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，電轉膜100伏1h,5% （w/v）脫脂奶粉20 溶液室溫封閉非特異性抗體 1h,一抗 RUNX2,BMPR2 和 GAPDH 按說明書 1:500~1 000 稀釋，作為內參。印跡膜加入一抗 4℃孵育過夜，用0.1%Tween 20 緩沖液洗膜三次，每次 5min.印跡膜加入antibody 二抗，孵育 1h,用 TBS/0.1%Tween 緩沖液洗膜三次，每次 5min.在近紅外成像系統Infrared Imaging System（觀察蛋白質印跡圖像及光密度軟件定量分析條帶灰度值。

1.3 統計學處理

實驗數據均為三次獨立實驗的結果，數據用均數±標準差（standard deviation,SD）表示。組間差異比較選用單因素方差分析One-Way ANOVA,統計軟件為（SPSS 13.0 版本），以 a=0.05 為檢驗水準，以（P<0.05）表明差異有統計學意義。RT-PCR 結果，應用公式-ΔΔ法計算OCN 表達量與第一天比較升高的倍數，△β,ΔΔCt = Δ- Δ.

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡下所見 人骨髓間充質干細胞 hMSCs 形態學觀察，骨髓細胞接種于塑料培養瓶后，細胞在培養瓶中散在分布，核呈圓形，橢圓形，核仁多而明顯。24h 后細胞貼壁，貼壁的細胞為單個，形態大部分呈梭形、三角形或紡錘形，培養天左右，細胞快速增殖，纖維細胞樣，放射狀排列生長（圖 1）。

2.2 成骨誘導生長曲線分析（MTT 法） 第 3 代hMSCs 的生長曲線見（圖 2）。成骨誘導組生長曲線呈 S 形，傳代接種后第 1、2 天細胞增殖緩慢為潛伏適應期，從第 3 天開始細胞增殖加速，細胞數目呈指數級遞增，此期為 hMSCs 的對數生長期。至第9 天達到頂點。隨著誘導時間延長 13~21 天增殖變得緩慢，進入平臺期。hMSCs 在成骨誘導培養基的作用下，逐漸向成骨細胞轉化，但 HMSCS 仍具有增殖能力。

2.3 細胞誘導分化的礦化作用
傳代培養中細胞加入誘導分化培養液，9d 后細胞長滿培養皿底，并開始密集重疊生長，無接觸抑制。10~21d,成骨誘導組可見重疊生長細胞逐漸形成較多散在的致密圓形礦化結節，隨后膠原堆積及鈣鹽沉積，礦化結節逐漸增大，結節周圍的細胞密度較高，輪廓不清，結節中心透光性差（圖 3）。此時，基礎培養作對照培養細胞雖密集重疊生長，但不形成礦化結節。

2.5 RT-PCR 檢測骨鈣素 OCN 的相對表達量

成骨標志物 OCN 隨誘導天數的增加逐漸增長，從第開始顯著增長，一直持續到 21d.

2.6 蛋白質印跡 RUNX2 及 BMPR2 蛋白表達量在成骨誘導組隨誘導天數增加表達逐漸加強。RUNX2 在誘導第 7d 顯著增加，而 BMPR2 在誘導第 14d 顯著增加。

3 討論

研究表明，hMSCs 易于獲取，可誘導分化為多種細胞,hMSCs 具有自我更新能力和組織修復功能，體內激素失衡及衰老引起的的 hMSCs 功能減退，失去成骨和軟骨分化能力，可以導致骨質疏松和骨性關節炎的發生.hMSCs 在骨組織工程（Tissue Engineering,BTE）細胞替代治療中有極其廣泛的應用前景。但人體 hMSCs 含量稀少，僅占骨髓細胞的百萬分之一.而組織工程需要大量的種子細胞，因此進行分離純化和體外擴增就顯得尤為重要。

McQuillan 等報道，β-甘油磷酸鈉可以為骨細胞分化和增殖提供磷原子，能增加堿性磷酸酶在成骨細胞中表達，從而促進生理性鈣鹽沉積鈣化。

還能夠促進骨鈣蛋白 mRNA 的表達以及蛋白分泌.地塞米松能提高堿性磷酸酶活性，誘導細胞表達骨鈣素，增加Ⅰ型膠原和骨橋素信使核糖核酸的合成，誘導 BMSCs 向成骨細胞轉化。維生素 C 促進體外培養細胞合成膠原，并調節堿性磷酸酶活性。

ALP 明顯陽性表達是 hMSCs 早期向成骨細胞分化的重要標志.本研究從誘導培養的早期，第五天可以檢測到 ALP 的活性，隨培養時間延長反應逐漸增強。ALP 是成骨細胞分化系列中的最重要標記，也是參與骨鈣化的重要蛋白之一。成骨細胞可通過基質小泡釋放出鈣離子，鎂離子和 ALP 等物質，鎂離子是堿性磷酸酶的激活劑，鈣離子在 ALP 的作用下沉積在膠原上，完成基質礦化過程。在成骨細胞分化過程中，ALP 和骨橋蛋白 OPN 相繼表達，而骨鈣素 OCN 的表達始于骨鈣化開始后。在成骨細胞表型形成過程中，OCN 的表達呈現發育階段特異性，茜素紅染色陽性表明在細胞結節形成時開始表達，基質礦化時達到最高水平。OCN、OPN 均屬于比較重要的非膠原蛋白，在骨鈣化過程中受到 RUNX2 的調節作用。

屬于 RUNX 轉錄因子家族成員，RUNX2 參與成骨細胞分化與骨骼形成過程，通過結合在啟動子或增強子核心元件部位調節骨發生的重要轉錄基因，包括 OCN、OPN 和骨唾液酸糖蛋白基因的轉錄,RUNX2 在促進骨膜和軟骨的骨化，促進骨化中心成熟過程中起著重要作用.

BMPR2 是一類結合在一系列分泌性骨形成蛋白上的II 型絲氨酸/蘇氨酸受體。BMPR2 屬于 TGF-β配體超家族成員，可以調節軟骨發生，骨細胞成骨過程，原腸胚的形成，神經元的形成等.BMP 結合在和 II 型絲氨酸/蘇氨酸受體可以誘導 Smad1/5/8 磷酸化進而活化下游的靶基因而在骨形成中發揮重要作用。本實驗采用β-甘油磷酸鈉、Vit C 和地塞米松作為成骨誘導添加劑，誘導的細胞能夠產生ALP,并具有礦化能力 OCN 的 mRNA 陽性表達以及蛋白質印跡實驗 RUNX2 和 BMPR2 蛋白的表達證明我們誘導分化后的 hMSCs 具備成骨細胞的生物學特性。

綜上所述，人的 hMSCs 在體外培養中增殖能力強，經體外誘導和分化的成骨細胞生長良好，表現出與典型的成骨細胞相似的形態特征和生物學特性，且周期短、重復性好，在骨組織工程中有良好的應用前景，為臨床開展自體成骨細胞修復骨缺損奠定了基礎。