0、引言
海馬在學習、記憶和內臟活動等方面起重要作用，與老年神經系統退行性病變密切相關。海馬正常發生發育過程是通過細胞增殖與凋亡的協調作用調節的。DCX是神經發生的合適標記物，短暫表達于增殖神經前體細胞，定量標記可反映神經發生水平高低。Caspase-3是細胞凋亡的主要執行者，也是判斷細胞凋亡的生化標志\\(biochemi-calmarker\\)。目前，應用基因敲除或轉基因動物模型研究神經退行性疾病多以C57/BL6小鼠為動物載體，但有關其海馬發育過程中細胞增殖與凋亡的系統研究尚鮮見報道。本實驗應用免疫組織化學染色、免疫熒光與免疫印記技術結合透射電鏡技術對C57/BL6小鼠海馬發育過程中細胞增殖與凋亡的變化規律進行系統和動態觀察研究，為深入探討海馬發生發育機制以及老年神經退行性疾病的機制研究提供基本的實驗依據。
1、材料與方法
1.1實驗動物培養與海馬標本制備
成年健康C57/BL6小鼠，按雌雄比例1∶2同窩飼養，以雌鼠陰道栓出現計為胚齡\\(E\\)0d;以仔鼠出生的最早時間計為生后\\(P\\)0d。選取胚齡12、14、16、18d胎鼠和生后1、3、5、7、14、21、28d及2、3m齡仔鼠，每組8只。孕鼠經4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后剖腹取出胎鼠，E10、12、14d的胎鼠取全胚，其余各胚日齡胎鼠和仔鼠斷頭取腦，4%多聚甲醛浸潤固定，經水洗后進入系列乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟定向包埋，行5μm厚連續切片，免疫組化及免疫熒光染色備用。各組取適量新鮮海馬組織置于－80℃保存，用于免疫印跡檢測分析。另取E12、16d和P1、P7d海馬組織切成約1mm3小塊，經3%戊二醛低溫浸潤固定48h后在經1%鋨酸后固定1h，常規電鏡標本制備，Epon812環氧樹脂定向包埋，LKB-V型超薄切片機半薄切片，厚度1μm，甲苯胺蘭染色，光鏡觀察海馬各區定位后再行超薄切片，厚70nm，重金屬雙染色，EX1200透射電鏡觀察。
1.2DCX免疫組織化學染色
采用石蠟切片免疫組化Envision法。切片常規脫蠟至水，3%過氧化氫溶液處理30min以去除內源性過氧化物酶，高壓修復抗原，加一抗\\(羊抗鼠DCX1∶200，SantaCruz公司\\)4℃過夜，滴加生物素標記的二抗\\(兔抗羊IgG，1∶200，北京中杉金橋生物有限公司\\)室溫孵育10min，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液室溫孵育10min，DAB顯色，蘇木素核復染，脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗。DCX陽性顆粒呈棕褐色，位于遷移中的神經元胞體以及分化中的神經元軸突。
1.3Caspase-3免疫熒光染色
石蠟切片脫蠟水化后，微波修復10min;加非免疫動物血清室溫孵育10min;加一抗\\(兔抗鼠Caspase-3，1∶200，SantaCruz公司\\)4℃過夜;加FITC標記山羊抗兔IgG\\(北京中杉金橋生物有限公司\\)37℃避光孵育30min，65%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，Caspase-3陽性顆粒呈明亮綠色熒光，分布于細胞漿。陰性對照用PBS代替一抗。
1.4Westernblotting檢測DCX和Caspase-3蛋白表達
各組冷凍海馬組織加入細胞裂解液，0℃下剪碎和超聲波粉碎20s后靜置30min，4℃下12000r/min離心20min，留取上清液，BCA法測定蛋白含量，并按每20μL含50μg蛋白制成樣品，－20℃冰箱保存。取已制備樣品適量加入電泳槽，100V電壓下電泳，轉膜，常溫下半干轉印，TBST沖洗后，5%小牛血清白蛋白室溫封閉1～2h。分別加入一抗\\(DCX和caspase-3抗體，稀釋度1∶200\\)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗脫3次，每次5min;分別加入二抗室溫孵育1h，TBST緩沖液洗脫3次，每次5min，ECL發光顯色;采用β-actin作為內參，掃描電泳條帶，用凝膠分析軟件分析各蛋白目的條帶吸光度。根據目的條帶與內參條帶吸光度的比值表示待測蛋白含量。
1.5統計分析
實驗結果采用統計軟件SPSS16.0處理，數據資料用x±s表示。對所測各項數據進行重復測量資料的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。
2、結果
2.1DCX免疫組化染色結果
DCX免疫陽性反應產物呈棕褐色，E12d陽性細胞出現在海馬結構原基中，E16～E18dCA區各層可見彌散分布的陽性細胞，P1d～P14d陽性細胞在錐體層外周排成一致密帶，P1d最寬，P14d消失;分子層及多形層中的陽性細胞，P1～P7d逐漸減少，P14d后消失。P1～P7d陽性細胞彌散分布于齒狀回各層，P14d主要分布于顆粒層內1/2，P21d主要分布于亞顆粒細胞層，P28d～3m亞顆粒細胞層陽性細胞逐漸減少\\(圖1\\)。
2.2Caspase-3免疫熒光染色結果
Caspase-3陽性反應物呈明亮綠色熒光，E12d海馬結構原基可見陽性表達;E16～E18d陽性細胞主要分布于CA區錐體層及齒狀回顆粒層;P1～P3d逐漸增多;P5～P14d逐漸減少;P21d～3m僅見少量陽性細胞\\(圖2\\)。
2.3電鏡觀察結果
\\(1\\)細胞增殖\\(圖3A，B\\):E12d和E16d海馬結構中見大量增殖細胞，P1d及P7d仍可見少量增殖細胞，表現為核染色質粗塊狀，排列散亂，核膜解體，核分裂相等;\\(2\\)細胞凋亡\\(圖3C，D\\):E16d、P1d及P7d均可見凋亡細胞，以P1d居多，表現核染色質濃縮邊集，細胞質皺縮，E12d未見到凋亡細胞。
2.4DCX與Caspase-3免疫印跡檢測分析結果
DCX與caspase-3免疫印跡蛋白條帶見圖4，蛋白表達分析結果:\\(1\\)DCX蛋白表達量:E18d～P3d逐漸增多\\(P＜0.01\\);P3～P5d無明顯差異\\(P＞0.05\\);P7d～2m逐漸減少\\(P＜0.01\\);2～3m無明顯差異\\(P＞d0.05\\)\\(圖5\\)。\\(2\\)Caspase-3蛋白表達量:E18d～P3d逐漸增加\\(P＜0.01\\);P5～P21d逐漸降低\\(P＜0.01\\);P21d趨于穩定\\(P＞0.05\\)\\(圖5\\)。
3、討論
海馬正常發生發育過程是通過細胞增殖與凋亡的協調作用調節的。DCX是研究神經發生的合適標記物，短暫表達于增殖神經前體細胞，定量標記可反映神經發生水平高低。Caspase-3是細胞凋亡的主要執行者，也是判斷細胞凋亡的生化標志\\(biochemicalmarker\\)。對細胞增殖與凋亡的形態學認別最可靠的方法是電子顯微鏡技術。
本實驗對C57/BL6小鼠海馬DCX免疫組化染色結果顯示:E12～E18d均可見大量陽性細胞，與Walker等對小鼠胚胎期神經發生的研究結果相似;P1～P14d陽性細胞在錐體層外周排成一致密帶，P1d最寬，P14d消失，與席剛明等對大鼠的研究結果相似，推測可能為新生神經元從外到內，由下托向齒狀回逐漸遷移所致;陽性細胞分布:P1～P7d主要位于齒狀回\\(DG\\)顆粒層和多形層，P14d主要位于顆粒層內1/2，P21d主要位于亞顆粒細胞層，P28d～3m亞顆粒細胞層陽性細胞逐漸減少，這種漸變規律與Muddanna等對大鼠的研究結果相似。本實驗DCX免疫印跡分析結果顯示:胚胎期至生后2w，DCX蛋白表達量先增后減，變化明顯，但均處于較高水平，2m后趨于穩定，與Muddanna等對大鼠的研究結果相似，結合本實驗電鏡觀察結果，E12d、P1d及P7d均可見增殖細胞，推測胚胎期至生后兩周為海馬結構細胞增殖分化遷移及體積增長高峰。
在海馬結構發生、發育及老化過程中始終同時存在著細胞增殖與凋亡，通過這兩個過程的協調作用才能保證海馬正常的發生、發育及老化過程。Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，也是凋亡的關鍵酶和執行者。LIU等對大鼠海馬研究結果提示:Casepase-3在P2d表達最強，以后逐漸降低，P21d后處于穩定的較低水平。
本實驗對C57/BL6小鼠海馬Caspase-3免疫熒光及免疫印跡結果與其相似:E12d～P3dcaspase-3陽性表達逐漸增多，P3～P21d表達逐漸減少，P21d后趨于穩定;結合本實驗電鏡觀察結果可見，P1凋亡細胞數量最多，推測小鼠海馬結構細胞凋亡高峰在P3d左右。
綜上所述，本實驗應用免疫組織化學染色、免疫熒光結合透射電鏡技術對C57/BL6小鼠海馬發生發育過程中細胞增殖與凋亡的變化規律進行了系統觀察研究，結果顯示:胚胎期至生后兩周為小鼠海馬細胞增殖和分化遷移高峰，凋亡高峰位于P1～3d;同時采用免疫印跡技術對發育中的細胞增殖與凋亡進行了對比性定量檢測，結果發現，小鼠海馬發育過程中，于E18d～P5dDCX吸光度比值高于caspase-3吸光度比值，而于p7～p3m則后者顯著高于前者，并隨鼠齡增長呈進行性增多和加重，說明發育早期增殖細胞數量明顯多于凋亡細胞數，以后隨鼠齡增長凋亡呈進行性增多。研究結果為深入探討海馬發生發育機制以及老年神經退行性疾病的機制研究提供了基本的定量形態學依據。
參考文獻\\( References\\)
［1］ Pereira A G，Portuguez M W，Dacosta D I，et al． Route learning performance: is it a hippocampus function?［J］． Cognitive and Behavioral Neurology，2011，24\\( 1\\) : 4 －10．
［2］ Walker T L，Takahiro Y，Adama J D，et al． The Dou-blecortin-expressing population in the developing and a-dult brain contains multipotential Precursors in addition to neuronal-lineage cells［J］． Journal of Neuroscience，2007，27\\( 14\\) : 3734 － 3742．
［3］ Pradelli L A，Beneteau M，Ricci J． Mitochondrial control of caspase-dependent and independent cell death［J］．Cellular and Molecular Life Sciences，2010，67 \\( 10 \\) :1589 － 1597．
［4］ Kroemer G，Galluzzi L，Vandenabeele P，et al． Classifi-cation of cell death: recommendations of the Nomencla-ture Committee on Cell Death ［J］． Cell Death and Differentiation，2009，16\\( 1\\) : 3 － 11．
［5］ 王堃，張蕊，郭敏． Nbn 基因對出生后小鼠海馬發育的影響［J］． 西 安 交 通 大 學 學 報，2009，30 \\( 5\\) :536 － 539．WANG Kun，ZHANG Rui，GUO Min． Effects of Nbn gens on posnatal development of mouse hippocampal for-mation［J］． Journal of Xi'an Jiaotong University\\( MedicalScience\\) ，2009，30\\( 5\\) : 536 － 539． \\( in Chinese\\) ．
［6］ Naylor A S，Bill C，Nilsson M K，et al． Voluntary run-ning rescues adult hippocampal neurogenesis after irradi-ation of the young mouse brain［J］． Proceeding of the National Academy Sciences of USA，2008，105 \\( 38 \\) :14632 － 14637．
［7］ 張敬坤，張莉，郭敏． C57 /BL6 小鼠海馬的發育和衰老［J］． 西安交通大學學報\\( 醫學版\\) ，2010，31\\( 5\\) :544 － 547．ZHANG Jingkun，ZHANG Li，GUO Min． The develop-ment and aging in C57 / BL6 mouse hippocampal forma-tion［J］． Journal of Xi'an Jiaotong University \\( Medical Science\\) ，2010，31\\( 5\\) : 544 － 547． \\( in Chinese\\) ．
［8］ Kerjana G，Koizumia H，Hanb E H，et al． Mice lacking doublecortin and doublecortin-like kinase 2 display al-tered hippocampal neuronal maturation and spontaneous seizures［J］． Proceeding of the National Academy Sci-ences of USA ，2009，106\\( 16\\) : 6766 － 6771．
［9］ 席剛明，汪華僑，唐廷勇，等． 大鼠海馬結構中細胞發生的時間及其遷移路線［J］． 解剖科學進展，1999，5\\( 3\\) : 199 －202．
［10］ Muddanna S R，Hattiagady B，Shetty A K． The win-dow and mechanisms of major age-related decline in the production of new neurons within the dentate gyrus of the hippocampus ［J］． Aging Cell，2006，37 \\( 5 \\) :545 － 555．
［11］ White L D，Barone S J． Qualitative and quantitative es-timates of apoptosis from birth to senescence in the ratbrain［J］． Cell Death and Differentiation，2001，8\\( 2\\) : 345 －356．
［12］ Liu J P，Chang L R，Gao X L，et al． Different expres-sion of Caspase-3 in rat hippocampal subregions during postnatal development［J］． Microscopy Research and Technique，2008，71\\( 2\\) :633-638.
