顱底的生長主要是由顱底軟骨聯合的軟骨內成骨作用的結果，所以軟骨聯合是顱底的發育中心。大鼠顱底前后向主要有兩個軟骨聯合:蝶骨間軟骨聯合和蝶枕軟骨聯合。我們研究了大鼠顱底形成和發育過程中，兩軟骨聯合細胞凋亡的分布情況以及凋亡相關因子\\(Fas\\)和一氧化氮\\(NO\\)凋亡途徑在其發育過程中的作用。
1、材料與方法
1.1試驗動物、試劑、儀器
動物:出生后4、8、16、32、48、64及128d的清潔級健康雄性SD大鼠，每組各5只\\(上海斯萊克實驗動物有限公司\\)。試劑:細胞凋亡TUNEL法檢驗試劑盒\\(美國Promega公司\\)，兔抗鼠iNOS，Fas多克隆抗體，生物素化羊抗兔IgG，DAB顯色液\\(武漢博士德生物工程\\)。儀器:CX21型光學顯微鏡\\(日本Olympus公司\\)，JD801型多功能圖像分析軟件\\(中國捷達公司\\)。
1.2方法
1.2.1標本制備TUNEL法及免疫組化染色，將大鼠用過量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下處死，取材范圍為篩骨前部到枕骨大孔，包括蝶骨間軟骨聯合\\(iss\\)和蝶枕軟骨聯合\\(sos\\)。取材后立即置于4%甲醛液固定24h，10%EDTA脫鈣4～16周。石蠟包埋，冠狀方向制備切片，厚5μm。取各組切片行TUNEL法和iNOS，Fas的免疫組化染色。
1.2.2結果判定標準及統計學方法TUNEL法結果判定，陰性對照:以高壓滅菌去離子水代替rTdT酶。陽性對照:同標本肌肉組織。以熒光顯微鏡下呈黃色熒光的細胞定位陽性。選5個具有代表性的高倍視野\\(400倍\\)并取300像素×300像素的面積計數凋亡細胞，取平均值，數據用均數±標準差表示，比較7組樣本均數的差別，行兩因素方差分析，當總體差別有統計學意義時，再用scheffe法兩兩比較。應用Stata10．0統計分析軟件對實驗數據進行統計學處理，P＜0．05表示有統計學意義。
免疫組化結果判定，陰性對照:以PBS代替一抗。以棕色顆粒定位Fas、iNOS陽性信號。選3個具有代表性的高倍視野\\(400倍\\)。Fas測定A值\\(opticaldensity，吸光度值\\)。iNOS測量IA值\\(累積吸光度值\\)。取平均值即為因子的表達量。統計方法同前，P＜0．05表示有統計學意義。
2、結果
2.1TUNEL法染色結果
4、8d組織的靜止區、增殖區、肥大區、交界區發現少量黃色熒光的凋亡陽性細胞，16d的肥大區、交界區和兩側的骨小梁間發現較多的凋亡細胞;32、48、64d標本的陽性細胞明顯增多，并且同天數標本的sos較iss的凋亡陽性細胞數要多，統計有顯著性差異\\(P＜0．05\\)\\(表1\\)。32d陽性細胞染色見圖1。而128d幾乎未見凋亡細胞。肌肉組織陽參標本可見強陽性表達。
2．2Fas免疫組織化學結果
4～64d組織皆有Fas蛋白表達，主要存在于肥大區和交界區細胞的細胞膜與胞質中\\(圖2\\)，細胞核中也有少量表達，另外靜止區和增殖區也可見淡染的棕黃色陽性細胞。128d時幾乎觀察不到Fas陽性細胞，sos情況基本同iss，無顯著差異\\(表2\\)。
2.3iNOS免疫組織化學結果
4、8、16d組織的靜止區有iNOS蛋白表達\\(圖3\\)，主要定位于細胞質中，為棕黃色陽性顆粒，表達量逐漸減少。而32～128d僅觀察到零星的陽性細胞。sos情況基本同iss，統計學無顯著差異\\(表2\\)。
3、討論
軟骨內成骨是顱底長度發育的基礎，而細胞的肥大、成熟、凋亡以及礦化又是軟骨內成骨過程的關鍵。所以礦化與凋亡是共存的。國外有研究證明細胞凋亡參與軟骨組織的代謝和生長發育并且已在小鼠顱底發現細胞凋亡現象。我們在正常大鼠顱底軟骨聯合組織中用TUNEL法檢測到了凋亡細胞，有力地佐證了這一觀點。軟骨細胞適時、適地、適量的凋亡，是顱底根據自身生長、發育、塑形需求而進行的生理性過程。通過調控不同類型細胞數量，進而調整骨形成和骨吸收之間的動態平衡，最終完成顱底骨的正常發育。
3.1Fas相關的細胞凋亡
受體介導途徑是細胞凋亡的重要途徑之一，Fas是一種細胞膜表面凋亡受體。Fas的配體FasL\\(Fasligand\\)與Fas結合后，可以激活caspase－3、caspase－7、Bid蛋白等凋亡相關因子，從而引發凋亡。Fas主要由細胞膜上表達，主要分布在肥大區、交界區軟骨細胞，靜止區、增殖區也有少量陽性表達。本實驗表明Fas陽性細胞的空間分布與TUNEL凋亡細胞分布位置大致相同，表明該途徑介導的凋亡與總凋亡有一致性，提示其在顱底軟骨聯合發育中發揮主要作用。
3.2iNOS相關的細胞凋亡途徑
NOS按表達方式分為自發型\\(包括神經型和內皮型\\)和誘導型\\(iducibleNOS，iNOS\\)兩種。iNOS只在細胞受到刺激如缺血缺氧、血紅素、細胞因子、IFN－γ、TNF－α、IL－1α后被激活表達。而iN-OS又可產生NO。NO是一種生理病理介質，能誘導多種細胞凋亡并引起各種疾病，其機制可能是通過影響胞外信號調節激酶\\(Erk\\)、p38、蛋白激酶C、細胞色素C等引發的。
NO途徑在軟骨生長發育中的研究較少，李發濤等的細胞培養實驗表明NO在兔生長板軟骨細胞凋亡中發揮重要作用，可以促進生長板軟骨細胞的終末分化。另有研究表明NO抑制劑不能影響Fas誘導的細胞凋亡，說明Fas與NO凋亡途徑相對獨立。
本實驗發現iNOS的表達幾乎僅分布在靜止區和增殖區。推測可能是4～16d軟骨聯合靜止增殖區的功能活躍，需氧量多，而其離骨髓腔相對較遠，缺血缺氧引起iNOS合成，生成NO，啟動凋亡。細胞凋亡的發生又使32d后靜止區細胞數量銳減，功能明顯減少減退，缺氧狀態隨之減輕。與凋亡現象的研究結果\\(靜止區和增殖區在4～16d有少量的TUNEL凋亡細胞存在，32d后幾乎沒有TUNEL凋亡細胞\\)相符。由于靜止區和增殖區在軟骨內成骨中發揮著重要的細胞儲備和增殖作用，而靜止增殖區又以NO凋亡途徑為主，所以該途徑在顱底發育中的作用不容忽視。
3.3顱底iss和sos在生長發育中的差異
Rice等發現顱底軟骨生長板的頭部、尾部生長速度有梯度變化，枕骨基部最快，蝶前骨的頭部最慢。Roberts等也發現軟骨聯合尾部的生長指數高，頭部的生長指數低而基蝶骨發育速度比基枕骨的發育速度要快。本研究發現相同天數標本的sos較iss的凋亡陽性細胞數要高，從一定程度上佐證了蝶枕軟骨聯合較蝶骨間軟骨聯合組織改建的速度差異，說明細胞凋亡程度的不同是導致其生長差異的重要因素之一。
而在Fas和iNOS陽性細胞的研究中，sos情況基本同iss類似，說明蝶枕軟骨聯合和蝶骨間軟骨聯合的外界生長環境基本一致，但兩組織對環境的反應卻不相同，這可能與凋亡級聯反應的其他因素有關，如可能兩組織細胞上fas配體數量不同，或存在某些抑制或促進生長的因子存在，這有待進一步的研究。
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