胚胎干細胞\\( embryonic stem cells,ES 細胞\\) 具有無限增殖和多向分化的特性,在體外可分化為 3個胚層的所有細胞[1],定向誘導人 ES 細胞分化為造血干/祖細胞,可以為造血干細胞移植提供新的細胞來源.目前誘導人 ES 細胞向造血細胞分化多采用 ES 細胞與基質細胞共培養以及擬胚體的方法[2,3],但是這兩種方法分化效率均比較低,而且存在動物源性污染,離臨床應用距離甚遠.本研究采用人 ES 細胞在胞外基質上直接貼壁培養向造血細胞誘導,既沒有擬胚體復雜的三維立體結構,又不受基質細胞的影響,從而排除異源性污染,旨在建立人ES 細胞分化為造血祖細胞的簡單高效的誘導體系,并探討不同的胞外基質對其分化的影響.
材料和方法
主要材料和試劑
人胚胎干細胞系 PKU1. 1 由北京大學第三醫院生殖中心陳貴安教授饋贈,為 PKU1 連續傳代 30 代后建立的單細胞克隆亞系,染色體核型為 46,XX[4].KnockOutTMDMEM 培養液、KnockOutTM血清替代品\\( SR\\) 和 IMDM 培養液以及胞外基質 Fibronectin和 Collagen IV 均為美國 Gibco /Invitrogen 公司產品; Matrigel 為美國 Becton Dickson 公司產品; 細胞因子均為美國 PeproTech 公司產品; HIT\\( 人血清白蛋白 + 重組人胰島素 + 人轉鐵蛋白\\) 和甲基纖維素培養液 MethoCult 4435+為加拿大 Stem Cell Tech-nology 公 司 產 品; 流 式 抗 體 均 為 美 國 BectonDickson Pharmingen 公司產品; Mini RNA 提取試劑盒為德國 Qiagen 公司產品; SYBR Green Super Mix為美國 Bio-Rad 公司產品; 引物合成由北京奧科公司完成.
胞外基質預處理培養板
設立 3 組: 分別將 Matrigel、Fibronectin 和 CollagenIV 置于 4℃ 融化,以預冷的 IMDM 按 1 ∶ 20 比例稀釋.各取 2 ml 均勻鋪于 6 孔培養板,37℃孵育 2 h,吸出后以 IMDM 清洗 1 遍,待用.
人 ES 細胞直接貼壁培養分步向造血干/祖細胞誘導第 1 步將生長 5 -6 d 后的人 ES 細胞經 Dispase 酶消化后,以基礎分化培養液\\( IMDM + HIT + MTG +谷氨酰胺 + 非必需氨基酸\\) 重懸,按 2 ×104細胞數/cm2的密度接種至胞外基質預先包被過的 6 孔培養板中貼壁培養,培養液中同時添加細胞因子骨形態發生蛋白\\( BMP4,25 ng /ml\\) 、血管內皮生長因子\\( VEGF,20 ng /ml\\) 和堿性成纖維生長因子\\( bFGF,10 ng / ml\\) 誘導 7 d; 第 2 步更換細胞因子為干細胞因子\\( SCF,50 ng /ml\\) 、芙萊基 3 配體\\( Flt 3L,50ng / ml\\) 、白介素 3 \\( IL-3,10 ng / ml\\) 和白介素 6 \\( IL-6,10 ng / ml\\) 繼續誘導分化 7 d,共誘導 14 d.每 3 d更換新鮮的培養基和細胞因子.在倒置相差顯微鏡下觀察分化細胞的形態.將人 ES 細胞在未經胞外基質包被的培養板上培養且不添加細胞因子設為對照組.
造血集落形成試驗\\( CFU\\)
收集培養液中誘導 14 d 的細胞,用 PBS 清洗 2 遍,用40 μm 無菌細胞篩過濾除去大的細胞團塊 ,將分化細胞按 1 × 105細胞數/ml 接種于半固體甲基纖維素培養基 MethoCult 4435+中培養,14 d 后在顯微鏡下觀察形成的細胞集落數目\\( CFC\\) .
流式細胞術分析\\( FCM\\)
收集培養液中誘導 14 d 的細胞,40 μm 無菌細胞篩過濾除去大的細胞團塊 ,將細胞密度調整為 5 ×105細胞數/毫升,用 PBS 清洗 3 遍,分別加入小鼠抗人CD34-APC、小鼠抗人 CD31-PE 和小鼠抗人 CD45-PE,同型對照為小鼠 IgG1-APC 和 IgG1-PE,4℃ 避光孵育 30 min.碘化丙啶\\( PI\\) 除去死細胞.上機分析分化細胞中各表面標志物陽性細胞的比例.
實時定量 PCR 檢測
分別提取人 ES 細胞以及誘導 3、7 和 14 d 分化細胞的總 RNA,反轉錄后采用 SYBR Green 法進行實時定量 PCR 檢測造血特異性基因的表達.反應總體系為 10 μl,反應條件為 95℃ 預變性 5 min; 然后95℃ 變性 10 s,退火 30 s,共 40 個循環.各基因引物序列及退火溫度\\( Tm\\) 見表1.采用2- ΔΔCt法進行數據處理.
統計學分析實驗數據以均數 ± 標準差\\(珔X ± SD\\) 表示,應用 SPSS17. 0 統計軟件分析,兩組之間進行 t 檢驗,3 組以上進行單因素方差分析\\( ANOVA\\) .P < 0. 05 為差異有統計學意義.
結 果
人 ES 細胞和分化細胞形態學觀察人 ES 細胞在無飼養層細胞的培養體系里呈巢狀集落樣生長,扁平狀,細胞之間界限清楚,細胞胞核大,胞質 少,核 質 比 高 \\( 圖 1A \\) .當 人 ES 細 胞 在matrigel、纖維粘連蛋白和 IV 型膠原蛋白這 3 種胞外基質分別包被過的培養板里培養,添加造血生長因子開始誘導分化,3 組分化細胞鏡下形態相似.
隨著誘導天數增加,人 ES 細胞邊界逐漸消失,分化出的細胞向四周擴散\\( 圖 1B\\) ,分化至 10 d 細胞表面開始出現許多囊腔結構\\( 圖 1C\\) ,里面充滿著圓形細胞\\( 圖 1D\\) ,隨著誘導時間的延長,這些圓形細胞有的會從囊腔結構中跑出來,漂浮在液體里,直至誘導 14 d 時分化細胞的表面布滿了圓形細胞\\( 圖1E,F\\) .在整個分化過程中,在對照組未出現囊腔結構以及圓形的細胞.
分化細胞的鑒定造血細胞集落形成 培養 2 周后各實驗組顯微鏡下均可觀察到紅細胞系、粒細胞系和混合細胞集落等各系細胞集落\\( CFC\\) 的形成\\( 圖 2B\\) ,3 組細胞數分別為\\( 10 ± 1. 5\\) × 105、\\( 16 ± 3. 5\\) × 105及\\( 51 ±6. 1\\) × 105,Collagen IV 包被組形成 CFC 數目明顯多于 Matrigal 和 Fibronectin 組,具有統計學差異\\( P< 0. 01 \\) ,其中形成 CFU-E 和 CFU-G 數目高于Matrigel 以及 Fibronectin 組\\( P < 0. 05\\) ,形成 CFU-GEMM 數 3 組間未見顯著差異 \\( P > 0. 05 \\) \\( 圖2A\\) .對照組未見有造血集落的形成.
特異性標志物的表達 流式細胞術分析誘導 14 d的分化細胞,結果顯示,Matrigel、Fibronectin 以及Collagen IV 組 CD34 陽性細胞數分別達到\\( 7. 18 ±0. 32\\) % 、\\( 9. 59 ± 0. 4 \\) % 、\\( 14. 42 ± 0. 69 \\) % ,Collagen IV 組高于前 2 組 \\( P < 0. 05 \\) ; 3 個組中CD45 陽性細胞數分別達到 \\( 0. 04 ± 0. 005 \\) % 、\\( 0. 05 ± 0. 01\\) %、\\( 1. 49 ± 0. 08\\) %,Collagen IV 組高于前 2 組\\( P <0. 05\\) ; 3 個組中 CD34 和 CD45 雙陽性的細胞比例分別為\\( 0. 08 ±0. 006\\) %、\\( 1. 16 ±0. 12\\) % 、\\( 7. 8 ± 0. 32\\) % ,Collagen IV 組顯著高于前 2 組\\( P <0. 05\\) ; 而 3 組中 CD31 陽性以及 CD34和 CD31 雙陽的細胞數占有的比例無顯著的差異\\( 圖 3\\) .在對照組細胞未檢測到 CD34、CD31 和CD45 的陽性表達.
實時定量 PCR 分析造血細胞特異性基因的表達從圖 4 可以看出,隨著誘導分化啟動,ES 細胞多能性標志物 Oct4 和 Nanog 在各組細胞中的表達迅速下降 至 消 失 \\( 圖 4A,4B \\) ,而 中 胚 層 標 志 物Brachyury、血液成血管細胞標志物 Flk1 以及造血系統特異性基因 CD34 和轉錄因子 SCL 在人 ES 細胞中\\( 即分化第 0 d\\) 幾乎不表達,分化第 3 d 時Brachyury 的表達量達到最高值,后逐漸下降直至消失,3 組之間未見顯著差異\\( 圖 4C\\) ; 3 組 Flk1 的表達在分化第 7 d 達高峰,3 組 Flk1 相對表達量分別為 25. 74 ± 3. 65,27. 83 ± 2. 41 和 63. 03 ± 7. 99,且Matrigel 和 Fibronectin 組顯著低于 Collagen IV 組\\( P <0. 05\\) ,此后 Flk1 的表達開始下調\\( 圖 4D\\) ; 隨著誘導天數的增加,CD34 和 SCL 表達均呈上調趨勢,分化第 14 d 時 Collagen IV 組的相對表達量分別為 82. 63 ± 10. 01 和 37. 5 ± 7. 57,明 顯 高 于Matrigel 和 Fibronectin 組,差異具有顯著的統計學意義\\( P <0. 01 和 P <0. 05\\) \\( 圖 4E,4F\\) .在對照組細胞未檢測到特定基因的表達.
討 論
定向誘導分化是人 ES 細胞研究的重要內容,將人ES 細胞誘導為造血細胞常采用傳統的基質細胞共培養和擬胚體誘導法,但是這些方法繁瑣,重復性查,獲得的細胞數量有限,而且分化體系中添加了成分不確定的胎牛血清,致使難以研究分化機制,也限制了其臨床應用.本實驗采用人 ES 細胞直接貼壁分化的誘導策略既沒有擬胚體復雜的三維結構,也不存在基質細胞或胎牛血清的動物源性污染,縮短與臨床應用的距離,同樣可以有效地產生造血祖細胞,這一方法成功的關鍵是胞外基質的選擇.研究表明,細胞微環境對維持人 ES 細胞自我更新以及細胞命運的決定極其重要,其中胞外基質是重要組成部分[5].胞外基質不但為細胞提供生長分化的支架,也提供維持細胞存活、遷移和命運決定的調控因子.胞外基質通常是大分子糖蛋白,包括基質膠\\( matrigel\\) 、纖維黏連蛋白\\( fibrobectin\\) 、膠原蛋白\\( collagen\\) 、層黏連蛋白\\( laminnin\\) 和蛋白多糖等.
本實驗采用人 ES 細胞接種至基質膠、纖維粘連蛋白和 IV 型膠原蛋白這 3 種胞外基質包被過的培養板上直接貼壁分化的誘導方法,產生的 CD34+造血祖細胞最高達到15. 06%,表達 CD45 的造血祖細胞可達 7. 8%,與傳統的基質細胞共培養和擬胚體法的分化效率相似,但是這一誘導方法簡單易操作,而且無血清、無基質細胞的培養體系更接近于未來的臨床應用.
造血過程中多種生長因子發揮著重要作用,外源性添加生長因子在一定程度上能模擬體內的造血微環境,促進造血發生.國外文獻報道,人 ES 細胞向造血細胞分化過程中需全程添加細胞因子,包括BMP4、bFGF、VEGF、SCF、Flt3L、IL-3 和 IL-6等[6,7].既往研究表明,人 ES 細胞向造血細胞分化過程中,只有 BMP4 能誘導產生對中胚層造血細胞發育必需的原條樣細胞群,啟動造血中胚層基因表達和少量造血祖細胞的產生; BMP4、VEGF、SCF 和bFGF 共同作用則誘導出高效的造血細胞[8].近年有研究證實,在人 ES 細胞向造血系分化過程中序貫加入不同的細胞因子更能有效地產生造血祖細胞[9].本研究整個分化過程中細胞因子分兩步添加,第 1 步加入 BMP4、VEGF 和 bFGF,第 2 步加入SCF、Flt3L、IL-3 和 IL-6,誘導 14 d 后對分化細胞進行鑒定,造血集落形成、流式細胞分析術以及實時定量 PCR 結果均證實人 ES 細胞有效地分化為造血祖細胞.本研究中外源性造血生長因子的添加誘導人ES 細胞開始分化,實時定量 PCR 結果顯示所有實驗組分化細胞中干細胞多能性標志物 Oct4 和Nanog 表達呈急劇下降的趨勢,盡管分化早期誘導效率很低,但是中胚層標志物 Brachyury、血液成血管細胞標志物 Flk1 以及造血系統特異性轉錄因子SCL 和基因 CD34 的相對表達量對于內參基因 β-actin 仍呈成倍增長,這是 ES 細胞一旦啟動分化,未分化狀態和多能性特性迅速喪失的結果[10].
本研究還比較了基質膠、纖維黏連蛋白和 IV 型膠原蛋白對產生造血細胞的不同作用.基質膠多用于人 ES 細胞無飼養層培養的培養皿處理[11],也可用于人 ES 細胞的貼壁誘導向造血細胞的分化[12].
纖維黏連蛋白和 IV 型膠原蛋白支持小鼠 ES 細胞來源的表達 Flk1 的祖細胞向造血細胞分化[13].纖維黏連蛋白能促進中胚層分化,誘導人 ES 細胞來源的內皮祖細胞向內皮細胞分化[14].IV 型膠原蛋白也能促進中胚層發育,誘導人 ES 細胞向內皮、心血管和造血系的分化[15],但具體的分化效率并未報道.本研究中造血集落形成實驗顯示這 3 種胞外基質上培養誘導的細胞均具有造血干/組細胞的造血集落形成能力,而且 IV 型膠原蛋白上形成的造血CFC 數目明顯高于其它兩組.流式細胞術分析顯示 IV 型膠原蛋白組 CD34+和 CD34+CD45+細胞數量顯著大于基質膠組和纖維黏連蛋白組; 實時定量PCR 結果顯示 IV 型膠原蛋白組造血特異性基因CD34 和 SCL 的相對表達量最高.由此證實,采用人 ES 細胞直接貼壁的誘導方法選擇 IV 型膠原蛋白更利于向造血細胞分化.
本研究建立了一種人胚胎干細胞在胞外基質上直接貼壁培養、有效地分化為造血祖細胞的新誘導方法,為造血祖細胞的大量產生以及進一步分化產生其它功能性血細胞提供足夠的細胞來源,同時發現 IV 型膠原蛋白利于人胚胎干細胞向造血細胞誘導,為胚胎干細胞的定向誘導分化提供技術平臺.
參 考 文 獻:
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