真核細胞的基因表達是高度復雜的過程,是遺傳調控和表觀遺傳調控協同作用的結果.遺傳調控以“基因決定論”為核心內容,表觀遺傳學則主要研究DNA序列以外的調控機制.已有研究結果證實,基 因 行 為 可 通 過 表 觀 遺 傳 的 行 為 進 行 調 控\\(Reik,2007\\),并可遺傳給后代.現今基于細胞生物學的表觀遺傳研究方向,旨在破譯表觀遺傳信號,哪些分子干預轉錄促使細胞自我更新和分化\\(圖1\\).
此外,解析甲基化的分子機制和不同細胞間表現形式的差異有助于關聯細胞類型相關疾病的全基因組與差異甲基化區域\\(DMRS\\)之間的關系,這已成為遺傳學的一個研究熱點.作者就DNA甲基化對影響轉錄、分子調控、神經元發育、遺傳等方面的最新研究成果進行綜述.
1、轉錄與甲基化
表觀基因組學的變化,包括DNA的化學修飾,可作為基因組的一層額外信息\\(Ray等,2013\\).甲基化,一種特殊的表觀基因組學修飾形式,是一種發生在胞嘧啶核苷酸特別是鳥嘌呤前胞嘧啶\\(cyto-sine-phosphate-guauine,CpG\\)的共價修飾.這個過程是 催 化DNA甲 基 轉 移 酶 \\(DNA methyltrans-ferases,DNMTs\\)轉移甲基S-腺苷甲硫氨酸到目標胞嘧啶的碳5上.此外還發現這種轉移酶家族的2個成員:DNMT1,主要功能是在DNA復制過程中維持DNA甲基化;DNMT3\\(包括DNMT3a和DN-MT3b\\),被認為是主要負責起始的CpG甲基化\\(蒙麗娜等,2013\\).在基因轉錄區域以外,基本都是甲基化的CpG.
CpG含量高的區域,被稱為CpG島,在哺乳動物啟動子中發現其含量約40%\\(Nigro等,1989\\),而在非CG序列上則被稱為non-CG\\(Dowen等,2012\\).研究結果表明,啟動子CpG島的甲基化狀態可能是控制基因表達的一個重要因素,用大量的甲基化阻斷基因轉錄,反之,則促進.此外,有證據表明,整個區域染色質的高甲基化可介導一整段基因的沉默,甚至延伸到相鄰的非甲基化基因\\(Bert等,2012\\).
DNA甲基化的精確調控在正常細胞分化及基因組印跡的過程中\\(一對等位基因中部分基因的特殊表達現象\\)十分重要.在腫瘤細胞中,能頻繁觀察到異常模式的DNA甲基化.一般情況下,癌細胞擁有全基因組的低甲基化和腫瘤抑制相關因子啟動子的超甲基化.由于全基因組的低甲基化導致基因組不穩定、基因印記損失,因而過度表達致癌基因\\(Trimarchi等,2011\\).與其相比,其余的基因組如腫瘤抑制基因的啟動子通常會表現出超甲基化,表明腫瘤抑制基因的表觀遺傳沉默與基因突變導致功能喪失具有同樣的效果,前者是后者的一種有效替代.
每種細胞個體的表觀遺傳都是通過早期進化結合CpG和蛋白修飾來協調或標記組織特異性基因的表達模式來形成的.在正常細胞中,大部分基因組是被DNA甲基化的,但與CpG島啟動的激活或使之變為雙價的基因通常未被甲基化\\(Cedar等,2012\\),這 種 缺 乏 甲 基 化 的 機 理 尚 不 清 楚.雖 然CpG二核苷酸是DNA甲基轉移酶\\(DNA methyl-transferase enzymes,DNAMTases\\)的首要目標,但DNAMTases從DNA一開始的甲基化到正常的發育和分化過程中基本上仍保持CpG二核苷酸的活性,這是否是由于活化了早已進化好的轉錄還是抑制了轉錄機制從而掩蓋DNAMTases上的CpG位點,亦或是激活去甲基化的作用,具體機制仍有待探索\\(Clark等,2002\\).在癌細胞中,CpG島啟動子高度甲基化常伴隨組蛋白抑制的標記基因的表達量增多\\(Baylin等,2011\\),這種通過“遠程的表觀遺傳沉默”\\(LRES\\)的現象,表明腫瘤發生過程中表觀遺傳不僅限于單個基因的失活,也可以是整個基因組的失活.典型的LRES特點一般都是通過增加CpG島的甲基化,抑制組蛋白修飾的H3K9二甲基化\\(H3K9me2\\)和H3K27三甲基化\\(H3K27me3\\),并結合失活的H3K9乙?；痋\(H3K9ac\\)一同來實現\\(Coolen等,2010\\).但最初公布在腫瘤中發現的全基因 組 低 甲 基 化 的 狀 態,卻 是 表 觀 遺 傳 的 特 例\\(Feinberg等,1988\\).長距離的低甲基化區域能覆蓋近一半的癌癥基因組\\(Cortessis等,2012\\),且在體細胞內也通常發現有部分甲基化的區域\\(Lister等,2013\\).傳統意義上認為,癌癥與LINE-1元素及其他重復序列的去甲基化有關\\(Kim等,2010\\),重復序列被發現與激活替代轉錄\\(Ross等,2010\\)和原癌基因過度表達有相關聯系\\(Ley等,2010\\),且CpG啟動子基因的去甲基化也被證明存在于多個癌癥的單獨基因里\\(Nishigaki等,2005\\).目前對特定基因的表觀遺傳激活已被證實是存在的,但專門針對在腫瘤細胞內全基因組表觀遺傳激活的范圍和基因組的相關關系卻鮮見報道.
2、雙加氧酶與胸腺嘧啶DNA糖基化酶對甲基化調控的機制
甲基化一直被視作是一種穩定的DNA標記,研究結果發現,只有在如受精這樣的全面重編程事件中它才會消失,可最近的研究結果表明,DNA甲基化并不是靜態的,絕大部分的基因組都是以甲基化和去甲基化動態平衡的形式存在\\(Song等,2013;Shen等,2013\\).針對此不同的研究結果是否可以這樣設想:這一效應是否可以被積極地逆轉?能夠證實這一假設正確性的辦法就是找到并阻斷其過程中的一個步驟來阻止這一周期性的變化.
最近有報道稱,雙加氧酶\\(ten-eleven transloca-tion,TET\\)蛋白可將甲基化的胞嘧啶\\(5-mC\\)氧化為5-羥 甲 基 胞 嘧 啶 \\(5-hydroxymethylcytosin,5-hmC\\),經研究證實,TET還可進一步氧化5-hmC為5-胞嘧啶甲酰\\(5-formylcytosine,5-fC\\)和5-胞嘧啶羧基\\(5-carboxytosine,5-caC\\),這些表觀遺傳學修飾也被稱為DNA的第5和6種,第7和8種堿基\\(Ito等,2011\\).然而,發現這些修飾堿基主要存在于小鼠胚胎干細胞中的DNA重復區域\\(Shen等,2013\\).通過堿基切除修復和使用高純度的單抗富集這些標記發現,胸腺嘧啶DNA糖基化酶\\(thy-mine DNA glycosylase,TDG\\)會用未修飾的胞嘧啶來代替5-fC和5-caC,并能選擇性地剪切由TET蛋白催化5-mC氧化產生的5-fC及5-caC,繼而啟動下游DNA剪切修復\\(base-excision repair,BER\\)通路,將5-mC還原成未修飾的胞嘧啶,而在耗盡TDG的 細 胞 中5-fC與5-caC產 生 積 累 \\(He等,2011\\),說明甲基化酶TET和TDG蛋白運轉了甲基化-去甲基化周期,并證實了甲基化是動態且廣泛的.
Wang等\\(2013\\)通過分析去甲基化中間體,結果發現其去阻遏是一種激活機制,很多被認為是未甲基化的區域其實上是在不斷地去甲基化.通過繪制5-hmC/5-fC/5-caC全基因組分布圖譜,結果發現,在野生型和Tdg缺陷的小鼠胚胎干細胞\\(ESCs\\)中可檢測到5-fC/5-caC在野生型小鼠的ESCs衛星重復序列上累積,相比之下,Tdg缺陷小鼠ESCs則在大量的近端和遠端基因調控元件上顯著累積了5-fC和5-caC\\(Shen等,2013\\).雖然目前對于這些去甲基化過程發生的程度及在基因組中的區域還不是很明確,但這些研究結果使研究人員進一步了解了DNA甲基化在細胞發育和功能方面所起的作用.
3、神經元的甲基化
大腦最前面的一部分稱為額葉皮質,額葉皮質對于思考、行動能力的形成起著重要作用.大腦實現這一切可通過特殊細胞的交互如神經元和神經膠質.眾所周知,這些細胞都有其獨特的功能,但如何定義這些細胞本身?答案在于每個細胞如何通過內在的DNA表達信息.大腦基因組甲基化從嬰兒到成年的整個過程中是以“non-CG”這種DNA甲基化的形式來呈現的,可以說是神經元專有的,且是神經元基因組的主要甲基化形式.另外,在研究誘導多能干細胞中發現其DNA甲基化形式也為“non-CG甲基化”\\(Lister等,2013\\).最初,研究者認為當干細胞分化為特殊的組織時這種甲基化形式就會消失,如肺臟細胞或脂肪細胞,但目前研究發現,這種甲基化形式并沒有在大腦中消失,隨著神經元細胞的分化仍 然 出 現 了 “non-CG甲 基 化”\\(Weng等,2013\\).隨著對老鼠和人的神經元及神經膠質在出生后、青少年和成年階段進行基因組測序,結果發現甲基化在神經元中逐漸積累,“non-CG甲基化”成為了神經元中的主要甲基化形式,表明成熟大腦神經元回路的建立是伴隨著表觀基因組學大規模重組的過程\\(Petanjek等,2012\\).這或許應對了最近的一些研究成果,如甲基化在精神分裂癥、抑郁癥、自殺和躁郁癥疾病中扮演著潛在的角色,由于這些DNA甲基化的特點出現在大腦神經元發育的關鍵階段,可影響神經網絡的形成,反過來,此后可能引起與腦的功能和疾病有關的變化\\(Tan等,2012\\).
4、表觀遺傳記憶
正如之前所提到在生殖細胞的成熟過程中,絕大多數表觀遺傳修飾會被抹去,這種重置機制會刪除相應的“環境記憶”,不過也會有一部分DNA將這種修飾保留下來.研究表觀遺傳這一重編程機制,不僅能加深研究者解析表觀遺傳學修飾在世代間傳遞的機制,還有助于對胚胎細胞發育的理解.
通過用Illumina測序平臺生成高分辨率的甲基化圖譜,標記未分化成熟的生殖細胞中DNA發生去甲基化的時機和位點,可觀察到甲基化往往出現在不活躍的基因上,且在時間上顯示大多數去甲基化事件比預想的要發生得更早.此外,令人興奮的是研究人員發現了能避開去甲基化的DNA區域,這很可能就是將環境影響遺傳給子代的機制\\(Seisen-berger等,2012\\).近年來有不少研究結果證實在哺乳動物中環境信息可傳遞到下一代,如高脂飲食的小鼠其后代的代謝也受到了影響,有過驚嚇經歷的雄鼠與雌鼠交配生下的小鼠比正常小鼠更膽怯,而同一只雄鼠通過人工授精所產下的小鼠則沒有表現出異常行為等\\(Dietz等,2011\\).
Jiang等\\(2013\\)以斑馬魚為模型,結果發現,子代選擇性地繼承父本而拋棄母本的DNA甲基化圖譜,研究人員共測量了斑馬魚卵子、精子、6個早期胚胎和精囊共9個時期全基因組的DNA甲基化序列,產生了約1200G的數據,結果發現,斑馬魚子代胚胎選擇性地繼承精子中的DNA甲基化,此研究結果被認為是對早期胚胎發育主要是由卵子決定這一傳統觀念的撼動.過去認為決定早期發育的信息幾乎都在卵子中.研究結果證明,在斑馬魚中除了DNA可以從父母傳遞到子代外,精子的DNA甲基化圖譜也可被遺傳到子代中,用于指導胚胎早期發育\\(Jiang等,2013\\).
而形成精子的細胞與形成卵子的細胞相比,DNA去甲基化發生得更為頻繁,意味著在表觀遺傳學修飾的遺傳方面來自父方的作用可能更大.雖然目前還不清楚環境信息的遺傳是如何發生的,但這些研究從機制上支持了上述現象.
5、小結
綜上所述,目前對于表觀遺傳學機制的探索仍處于較初級的階段.可以預見的是,應用高通量測序技術與單克隆抗體標識追蹤技術來研究各種正常組織及癌癥組織的DNA甲基化數據將不斷涌現,利用這些不同組織的DNA甲基化數據,可以深層次地探討表觀遺傳學在生物間的差異性及組織特異的表觀遺傳模式.雖然甲基化激活的分子通路及關鍵因子的發現也能在一定程度上解釋細胞分化中的一些現象,但是否存在其他更多甚至更重要的因素參與其中及更系統全面的揭示其真實機理都有待于進一步的試驗來推動.另外,結合其他表觀遺傳現象對人類基因組進行系統的研究勢必成為醫學上認識疾病基因表達的必然之路.利用這些與特定疾病相關的DNA甲基化標識對疾病進行檢測,使之成為藥物靶點也是極具熱點的發展方向.
參 考 文 獻
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