前言
葉酸（folate）是在綠葉蔬菜、谷物和動物肝臟中發現的一種 B 族維生素，主要參與 DNA 合成和甲基化過程，對胎兒的生長發育至關重要。近年研究發現， 母體低葉酸水平可能會增高胎兒宮內發育遲緩（Intrauterine Growth Retardation, IUGR）的發生率,但其分子機制尚不清楚；以往動物模型的研究提示葉酸缺乏會引起胎鼠重量下降,但也沒有對其進一步的機制探討。
目前認為，IUGR 的病因是多種因素作用的結果， 其病因學包括環境因素和遺傳因素?，F今很多研究證實胰島素生長因子（insulin-like growth factor, IGF）、瘦素（leptin）、葡萄糖轉運蛋白（Glut）及凝血因子Ⅳ等與胎兒 IUGR 密切相關.胰島素或IGF 分泌和功能的異常，是目前研究的熱點.IGF 是生長發育所必需的、起重要作用的生長調節因子， 是胎兒出生前和出生后生長的主要刺激物，與嬰兒出生體重密切相關.IGF 系統包括胰島素生長因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、胰島素生長因子Ⅱ（IGF–Ⅱ）、胰島素生長因子受體Ⅰ（IGF-ⅠR）、胰島素生長因子受體Ⅱ（IGF–ⅡR）、胰島素生長因子結合蛋白 1（IGFBP-1）和胰島素生長因子結合蛋白 3（IGFBP-3）等，IGF-Ⅰ、IGF–Ⅱ結構類似于胰島素，是重要的促分裂素，影響細胞生長和代謝，并通過自分泌、旁分泌和內分泌方式影響細胞增殖和分化，調節機體的生長發育.近期有研究表明，葉酸缺乏會導致孕鼠血清和孕18 天胎鼠顱骨中 IGF-1 蛋白含量降低;韓國 Kim HW 的一項研究也表明雄鼠葉酸缺乏會導致子代胎鼠腦中 IGFⅡ的表達量下降,這說明葉酸缺乏可能會影響 IGF 系統相關基因的表達水平。
本實驗通過建立葉酸缺乏孕鼠模型，研究圍孕期母鼠葉酸缺乏對胎鼠發育的影響，并在葉酸主要存儲器官肝臟組織中測定了 IGF 系統相關基因表達水平，進而對葉酸缺乏致胚胎異常發育的機制進行了初步的探討。
1 材料與方法
1.1 材料
C57BL/6J 清潔級雌性成年小鼠 12 只購自中國醫科院實驗動物中心，飼料配方中的氨基酸、維生素等購自美國 Sigma公司。實時熒光定量 PCR 儀（7500 fast） 為 ABI 公司產品；Nan-odrop 1000 分光光度計為 Thermo Scientific 公司產品；引物自上海生物工程技術有限公司合成；熒光染料 SYBR Green I 購自康為世紀公司；RNA 提取試劑盒購自美國 QIAGEN 公司；RNA 反轉錄試劑盒購自美國 Invitrogen 公司。
1.2 方法
1.2.1 動物模型的制備 健康清潔級未經產的成年 C57BL/6J 雌鼠 12 只，12 周齡，體重 19.1-21.2 g.按體重排序，隨機分為正常對照組（Control）和葉酸缺乏組（FD）兩組，每組 6 只。對照組小鼠喂養飼料以 AIN-93G 標準飼料配方為基礎，其中氨基酸、礦物質和維生素混合物按 Bills N.D.等人建立的氨基酸限定配方進行調整；葉酸缺乏組小鼠喂養飼料是在對照組基礎上剔除掉葉酸，具體成分詳見表 1.兩組小鼠皆自由進水和飲食，所有雌鼠先飼養于普通塑料籠具內單籠喂養，4 周后與正常成年C57BL/6J 雄鼠 1:1 合籠交配。每日下午 17:00 合籠，次日清晨檢查陰栓，陰道口有乳白色或黃色凝固物者為見栓，記為 E0.5d,后轉入普通飼養籠中，繼續喂飼各自飼料直至取材。本研究使用的動物由實驗動物使用與管理委員會審查許可（編號：IL-AS-PL-2012-001）?！颈?】
1.2.2 實驗記錄及取材 每周用電子天平稱量雌鼠體重，準確至小數點后一位數。取材時間為孕 13.5 天（13.5 dpc）當天的 8:00~10:00,記錄孕鼠每窩總胎數、活胎數、吸收胎數和死胎數；測量記錄胎盤重量、胎鼠重量、胎鼠體長。計算并統計胎鼠 IU-GR 比率，以正常對照組胎鼠平均出生體重減去該組標準差的2 倍為基準，胎鼠重量小于或等于此標準者評定為 IUGR.取13.5 dpc 胎鼠肝臟組織，每一窩胎鼠的組織放入同一個凍存管中，液氮速凍，-80℃冰箱保存。
1.2.3 實時熒光定量 PCR 稱取 13.5 dpc 小鼠胚胎肝臟組織 20mg,每組各 6 個標本，采用離心柱法提取總 RNA,Nanodrop1000 分光光度計測總 RNA 濃度。采用 Real-time PCR 法檢測肝臟組織中 IGFⅠ、IGFⅠR、IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR、IGFBP-1 和 IGF-BP-3 mRNA 的水平，引物序列見表 2.Real-time PCR 反應體系20 μL,擴增反應條件為：50 ℃ 20 s、95 ℃ 10 min 后，以 95 ℃15 s、60 ℃ 1 min 循環 40 次，每份樣本做三個重復孔。采用與內參基因 Gapdh 比較的△△CT 法計算 IGF mRNA 的相對表達量?！颈?】
1.3 統計學處理采用 SPSS 16.0 軟件，數據以± SEM 表示，組間計量資料的比較采用獨立樣本 t 檢驗，吸收胎與死胎的比率、IUGR 發生率的比較采用 X2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 兩組雌鼠體重的變化
隨機分組的兩組雌鼠的初始體重沒有統計學差異（P>0.05），在分別飼以相應飼料后，與正常對照組相比，葉酸缺乏組雌鼠合籠前四周體重每日的增長量降低，差異有統計學意義（P<0.05）；而孕后至取材時的雌鼠體重每日的增長量兩組間沒有差別（P>0.05）（表 3）?！颈?】
2.2 兩組孕鼠吸收胎和死胎發生率的比較
在 13.5 dpc 取材時葉酸缺乏組的胎鼠總數為 51 只，其中吸收胎 14 例；正常對照組的胎鼠總數為 54 只，其中吸收胎 3例，死胎 3 例；與對照組相比，葉酸缺乏組吸收胎和死胎率升高1.47 倍，X2檢驗結果顯示，兩組差異具有統計學意義（P<0.05） （表 4）?！颈?】
2.3 胚胎發育評價及 IUGR 發生率的比較
兩組孕鼠（每組 6 只）解剖結果發現，葉酸缺乏組有 37 例活胎，正常對照組有 48 例活胎，為兩組間胎鼠的形態對比圖，可見葉酸缺乏組胎鼠體型偏小。與對照組相比，葉酸缺乏組平均胎鼠重量顯著降低，是正常對照組胎鼠重量的 74.06 %,差異具有顯著性（P<0.01）。計算統計兩組間胚胎 IUGR 的發生率，分析發現葉酸缺乏組顯著高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.001）。胎盤重量和胎鼠頂臀長分析結果顯示葉酸缺乏組略低于正常組，但沒有統計學差異（P>0.05）（表 5）?！颈?】
2.4 胎鼠肝臟 IGF 系統基因相對表達量變化
胎鼠肝臟標本中 IGF 系統 mRNA 的相對表達水平分析結果顯示，葉酸缺乏組 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR mRNA 水平均低于正常對照組，分別降低 58.45 %和 32.64 %,且兩組間差異有統計學意義（P<0.05）；相反，IGFⅠ、IGFⅠR、IGFBP-1 和 IGFBP-3 的mRNA 相對表達水平，兩組間沒有統計學差異（P>0.05）。
3 討論
3.1 葉酸缺乏與胚胎發育葉酸作為一種水溶性維生素，參與 DNA 的合成與甲基化，對細胞的生長至關重要，近年來很多文獻報道發現葉酸和胎兒發育關系密切。Sram RJ和 Relton CL 等人發現在早期妊娠的孕婦和新生兒中，有吸煙習慣的孕婦葉酸水平降低，且新生兒體重普遍偏低，兩者高度相關。巴基斯坦的 Lindblad B發現IUGR 組母血和臍血中葉酸的水平是正常對照組的一半；澳大利亞的 Furness D 學者發現妊娠 18-20 周、發生 IUGR 的孕婦中，紅細胞葉酸水平低于對照組，同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）高于對照組，并且在淋巴細胞可見 DNA 損傷的標志 - 微核和核質橋現象增多，這表明在妊娠中期母體的低葉酸和高Hcy 水平與 IUGR 相關。印度的 Gadhok AK通過采集妊娠晚期 150 名 IUGR 和 30 名正常孕婦的血樣，比較 Hcy、葉酸和VB12 的水平，發現 IUGR 組孕婦血清 Hcy 的濃度高于對照組，而葉酸和 VB12 的濃度低于對照組。國內的蔡衛華分別研究了不同孕期的 IUGR 孕婦，發現 IUGR 組各孕期紅細胞葉酸水平均低于對照組，且新生兒體重與母血紅細胞葉酸水平密切相關。綜上所述，妊娠早期、中期、晚期孕婦自身的低葉酸水平都會導致新生兒 IUGR 的發生率上升。
葉酸缺乏動物研究結果也發現，低葉酸飲食母鼠的懷孕率降低，孕鼠的孕期體重增加減少，孕鼠宮內活胎數減少，吸收胎、死胎比率增加，胎鼠重量下降，而大部分活胎的大體形態學都顯示正常.Xiao S 等建立的葉酸缺乏模型是在飼料中添加 0.033 mg/kg、0.066 mg/kg、0.132 mg/kg 等不同含量的葉酸，并且加入 1 %的琥珀磺胺噻唑（ss）以抑制腸道葉酸的合成，膳食干預 8 周后合籠。Heid、Burgoon 等建立模型的方法與前者類似，不同的是在小鼠合籠前分別膳食干預 5 周和 4 周.本實驗中葉酸缺乏組小鼠采用剔除葉酸的飼料配方，以控制外源性葉酸的攝入；并且為了最大程度地模擬孕婦在圍孕期的低葉酸狀態，并且便于獨立評價葉酸缺乏對胚胎發育的不良作用，本實驗并未采用 ss 腸道抑制劑，以排除其對胚胎發育的潛在影響。小鼠胚胎的器官形成期為第 10-14 天，因此我們選擇13.5 dpc 器官形成的末期來觀察葉酸缺乏對中孕期胚胎發育的影響。Bills N.D.等曾采用此方法成功建立了葉酸缺乏的小鼠模型，干預 5 周后發現小鼠體重、肝臟和紅細胞等的葉酸含量都明顯下降。廖國儀等人也采用類似方法建立了葉酸缺乏的孕鼠模型，通過孕前干預 2 周，發現孕晚期（E20 d）胎鼠的平均體重、鼻 - 臀長、腦重均低于對照組。本實驗中雌鼠妊娠結局與上述文獻結果一致，葉酸缺乏組雌鼠合籠前體重增長下降，孕鼠中吸收胎和死胎比率升高，胎鼠重量低于正常對照組，這說明在小鼠的孕中期，葉酸缺乏引起的胎鼠發育受限就已經得到了體現。以往實驗雖表明葉酸缺乏會導致胎鼠重量下降，但均未嚴格的采用 IUGR 判定標準計算比率，本實驗采用標準差法首次描述并判定了葉酸缺乏致小鼠胚胎 IUGR 的發生率。
3.2 IGF 表達與 IUGRIGF
系統包括兩種配體（IGF-Ⅰ， IGF-Ⅱ），兩種受體（IGF-ⅠR, IGF-ⅡR）、六種 IGF 結合蛋白（IGF-binding proteins, IGFB-Ps）、IGFBP 相關蛋白 （IGFBP-related proteins, IGFBP-rPs） 和一組 IGFBP 蛋白酶.IGFs 在局部組織環境中通過自分泌和 （或）旁分泌機制，配體和受體相結合，激活下游效應因子，發揮促有絲分裂作用， 并可誘導細胞分化和促進許多細胞分化后功能表達。IGFBPs 是與 IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ有高結合力的一組蛋白，循環中 IGFs 的濃度隨著 IGFBPs 的變化而變化，它們是 IGFs 生物功能的調節劑，能將 IGFs 轉運并定位到特定的細胞中，延長循環中 IGFs 的半衰期以調控其促生長活性，其中 IGFBP-3 在血中的含量最高，是 IGFs 的主要載體蛋白，IGFBP-1 也能快速調節血漿中 IGFs 的活性， 并可在細胞水平上調節 IGFs 的物質.研究表明，IGFs 是調節胎兒生長發育的重要物質之一，亦是控制胎兒生長有效的有絲分裂素.由于肝臟是動物中葉酸存儲和代謝的主要器官,也是產生 IGFs 的主要器官，所以我們選取胎鼠肝臟標本為研究對象，探討 IGF 系統基因的表達變化。
IGF-Ⅱ是重要的胚胎期生長因子，可在胎盤中調控糖原合成及合成細胞的量, 是調節葡萄糖轉運的主要因子。IGF-Ⅱ不但可以促進細胞的增殖、分化、成熟，還可抑制細胞的凋亡；它可以介導生長激素的大部分作用，可促進機體的生長和合成代謝，并有調節免疫、降低血糖等作用，它還在肌肉和脂肪組織中具有胰島素樣作用，可通過和胰島素 A 型受體高親和性的結合從而發生細胞絲裂效應.IGFs 的生物學功能需要通過特異性的 IGF- 受體介導完成， IGF-ⅠR、IGF-ⅡR 兩種受體分別與各自的配體以高親和力結合， 只存在 10 %的交叉配體.IGF-ⅡR 是一種分布于細胞胞質和高爾基體上的跨膜糖蛋白，它在處于活躍增殖期的胚胎肝臟細胞內呈現高表達狀態。自分泌生長刺激機制是肝癌細胞惡性增殖的重要原因，而 IGF-Ⅱ與IGF-ⅡR 的過量表達可能是其中一個分子基礎.在本實驗中葉酸缺乏組 13.5 dpc 胎鼠肝臟中 IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR 的表達量均低于正常對照組，說明兩者可能存在協同作用。Calvo MT 等研究證實，IUGR 胎兒 IGF 基因表達明顯受抑制。多項國內研究，通過對比分析 IUGR 孕婦和正常孕婦在孕中期及分娩時羊水、母血、臍血中 IGF 系統的表達，發現無論在孕中期還是分娩時，IUGR 組臍血或羊水中 IGF-Ⅱ水平都較對照組顯著降低.
動物研究發現，IGF-Ⅱ基因敲除鼠顯示出明顯的 IUGR 及胎盤縮小， 雖生后可顯示近似正常的生長速率， 但實際體重、身長仍低于正常對照鼠，同時敲除 IGF-Ⅰ及 IGF-Ⅱ基因鼠顯示嚴重 I-UGR, 所有鼠生后均死于呼吸衰竭.另外，Lassarre 等發現，IGF-Ⅱ基因過度表達， 胎兒體重及生長發育速度明顯增加。以上實驗結果證實了 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 在胎兒生長發育中的重要作用，與 IUGR 密切相關。
3.3 葉酸缺乏與 IGF
Santoso MI研究過葉酸缺乏與 TGF-β1 和 IGF-Ⅰ表達量之間的關系，發現葉酸缺乏組母鼠血清和胎鼠顱骨中 TGF-β1和 IGF-Ⅰ的表達量都比對照組低；近期 Kim HW的研究表明父體葉酸缺乏會導致子代胎鼠腦部整體甲基化降低，并使 IGF-Ⅱ蛋白表達量下降。研究提示葉酸缺乏會影響 IGF 系統中相關基因的表達，而在本實驗建立的葉酸缺乏小鼠模型中，胎鼠肝臟組織 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 的表達量也發生了類似下降。由于葉酸為蛋氨酸合成所必需，而蛋氨酸的代謝中間物 S- 腺苷蛋氨酸在甲基轉移酶的作用下轉變為 S- 腺苷同性半胱氨酸的過程為體內廣泛存在的甲基化反應提供甲基，而 DNA 的甲基化是調控基因表達的重要形式。有研究表明，IGF-Ⅱ基因的差異性甲基化區（DMR） 去甲基化狀態使其能與增強子阻遏蛋白（CTCF） 結合，CTCF 能阻斷增強子對 IGF-Ⅱ基因啟動子的作用，使 IGF-Ⅱ不能有效地轉錄，進而降低 IGF-Ⅱ基因的表達.在本實驗中，IGF-Ⅱ表達水平的降低，可能是由于母鼠的葉酸缺乏狀態影響 IGF-Ⅱ基因 DMR 區的甲基化程度引起的。由于體內循環中 IGF 因子減少，可能無法滿足細胞生長的正常生理需要，進而影響胚胎的生長發育。
綜上所述，本文通過建立圍孕期葉酸缺乏的小鼠模型，研究了母鼠葉酸缺乏對胎鼠發育和肝臟 IGF 系統基因表達的影響，結果表明葉酸缺乏會引起孕中期小鼠 IUGR 率增高且降低13.5 dpc 胎鼠肝臟內 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 的表達水平。研究結果提示，葉酸缺乏對 IGF 系統基因的調控，可能參與到胎鼠 IUGR率增高的機制之中。胎兒的生長是多因素共同作用的，本文對與胚胎發育關系較密切的部分 IGF 基因進行了測定， 除 IGF-Ⅱ和 IGF-ⅡR 的表達量發生變化外，其他基因未發生變化。在后續研究中，將擴大樣本量，檢測組織葉酸濃度，并對 IGF 基因的甲基化程度進行測定，進一步探討葉酸缺乏改變 IGF 基因表達、影響胚胎發育的機制。
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