多重鏈接探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）最早是由荷蘭的Schouten博士于2002年發明的，是一種高通量、針對待測核酸中靶序列進行檢測和分析的新技術[1].該技術僅需20 ng/μL模板DNA或RNA,即可通過簡單的探針雜交、連接及PCR擴增和電泳步驟，在同一反應管中對多達50個不同的靶基因進行檢測和分析。該技術經過短短幾年的發展，目前已經在遺傳疾病、基因甲基化分析等多個領域中得到了廣泛應用[2-3].
1MLPA的原理
MLPA技術是將核酸的雜交檢測和PCR鏈式擴增相結合，從而實現多對靶分子的高效特異性分析。其核心技術是設計與目的靶序列高度特異性的長探針和短探針，發生MLPA反應時，這兩段探針首先分別與模板序列雜交，之后通過連接酶將兩段探針進行連接。連接反應高度特異，只有當兩個探針與靶序列完全雜交，即靶序列與探針特異性序列完全互補，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補，即使只有一個堿基的差別，就會導致雜交不完全，使連接反應無法進行。長探針和短探針發生連接后，生成一條兩端分別含有上下游通用PCR引物的全長探針，并在通用引物的擴增之下，使模板成鏈式放大，最后生成的PCR擴增產物通過毛細管電泳分離，再經軟件分析[1].
2MLPA反應步驟
2.1 探針與靶序列雜交
在MLPA反應中，一個目標序列需要設計一對探針，包括長探針和短探針，短探針由兩段核苷酸組成，包括位于5‘端的PCR通用正向引物序列和位于3’端的模板特異性序列；長探針由三段核苷酸組成，包括位于5‘端的模板特異性序列和3’端的通用反向引物序列外，在兩者之間還添加了大小不等的填充序列（指紋序列），填充序列不是必須的，主要是用于區分擴增產物的大小。MLPA反應時，首先將雙鏈DNA在98℃變性裂解，裂解為單鏈DNA,溫度降為60℃時長短探針分別與單鏈DNA過夜雜交[1-3].
2.2 探針的特異性連接
調節溫度降為54℃，加入連接酶。如果被檢核酸中含有靶序列，則長短探針可均與模板序列互補良好，連接反應可以進行，長短探針可以連接為一條完整的核酸單鏈。若其中一條探針的序列與被檢靶基因序列不完全互補，即使只有一個堿基不互補，也會使雜交不完全而使連接反應無法進行。這種連接是高度特異性的，保障了MLPA的高特異性優勢[1-4].
2.3PCR擴增
MLPA擴增的并不是被檢樣本核酸，而是上述連接生成的與靶序列結合的完整核酸探針，只要有一條完整的核酸單鏈生成了，PCR擴增反應即可進行，這保證了MLPA技術的高靈敏性。連接反應完成后，每一條完整的核酸單鏈5‘端都帶有通用PCR正向引物，3’端都帶有通用PCR反向引物。由于事先給每種被檢基因的長探針加入了特定大小的指紋序列，每對探針的擴增產物的長度都是唯一的，在通用引物的擴增下，這些大小不同的擴增片段被同時擴增了出來，一般相鄰兩產物的長度差可以在10 bp之間，這樣可以同時檢測的基因數可高達50種不同靶基因[1-4].
2.4 毛細管電泳分析
PCR擴增產物可用瓊脂糖凝膠電泳分離分析，也可通過毛細管電泳等進行分離分析。但一般情況下由于多重擴增的不同片段之間相差較小，而且，擴增片段大小多集中于90~150之間效果較好，普通瓊脂糖凝膠電泳無法分離，建議使用毛細管電泳，再用相關軟件分析電泳結果[2,4].
3MLPA的優缺點
MLPA作為一種新型檢測技術，具有如下優點：1.靈敏度高，所需樣本量小，最少僅需20 ngDNA即可完成檢測，檢測限可達3 000~6 000個靶分子；2.多重分析，可同時檢測多達50檢測靶基因；3.特異性強，檢測精準度高，可以區分單個核苷酸不同，保證了檢測的特異性；4.高通量，一個反應可以同時檢測多種病原，有利于疫病的及時確診；5.自動化程度高，在PCR結束之后直接可用毛細管電泳分析結果，操作易于標準化；6.一次檢測可完成96個樣品的檢測[1-2].
MLPA技術盡管有諸多優點，但其畢竟是一種新技術，局限性特別是應用方面的局限性是難免的：1.目前普及程度不高，試劑比較昂貴；2.探針設計比較困難耗時，不過一旦前期設計完成，后期的高通量檢測工作即容易進行；3.由于需核酸雜交，操作比較繁瑣而且費時；4.應用受限制，目前更多的應用還是基因突變和甲基化檢測，在其他領域進展緩慢。
4MLPA的應用
4.1 用于檢測人類基因或基因片段的缺失或重復
人類很多遺傳性疾病都跟基因缺失或突變有關，因此MLPA多年來在基因遺傳性疾病的研究及臨床監測中發揮了巨大應用。如MLPA技術已用于遺傳性非息肉性結直腸癌的鑒別以及卵巢癌和乳腺癌患者的預后等，也可用于多種遺傳病的基因定量研究，如苯丙酮尿癥，杰格斯綜合征及多發性神經纖維瘤等[5].
4.2 用于檢測由染色體異常引發的疾病
染色體重排常引發智力發育遲緩及其他多種神經系統疾病。MLPA可以檢測出染色體重排或微小重排。已有多家實驗室對MLPA技術在檢測精神發育和神經系統疾病中的應用進行研究，已報道的有Williams綜合征、Sotos綜合征及Axenfeld-Rieger綜合征等[3].MLPA可以識別單個核苷酸的差異，因此可用于單核苷酸多態性和各種點突變的檢測。MLPA技術也可以檢測染色體數目的異常，如唐氏綜合征等。
4.3MLPA在腫瘤檢測方面的應用
大約30%的人類腫瘤基因組中存在DNA拷貝數異常，其中DNA拷貝數增加是癌基因激活的重要方式。由于MLPA技術可檢測出DNA拷貝數量的異常，因此已被應用于多種腫瘤的檢測中。2003年，Eldering等[6]在MLPA技術基礎上建立了逆轉錄-MLPA（RT-MLPA），該技術改進能夠發現m RNA低拷貝數變異。此外，細胞全基因組水平的低甲基化和局部區域關鍵基因的高甲基化也是腫瘤的基本特征，且其甲基化狀態的改變往往出現于細胞惡性增生早期，并隨惡性腫瘤的發生、發展而變化。因此，檢測細胞甲基化狀態對腫瘤的預防、治療及觀察預后都有極其重大的意義。甲基化特異性MLPA（methylation-specific MLPA,MS-MLPA）是一種由MLPA技術部分改進而成的可檢測基因甲基化情況的新技術[1,7],可以實現此目的。
4.4 用于傳染病的高通量檢測
MLPA被報道以來主要用于基因遺傳病的檢測，近些年逐漸發展到傳染病高通量檢測，表現出了良好的發展勢頭。Martin等人建立了可以同時檢測15種呼吸道病毒的MLPA方法，敏感性與單個熒光PCR相當，但檢測通量大大提高了[8].Muvunyi等建立了MLPA同步檢測7種性傳播疾病，結果用單重熒光PCR驗證，符合性達到100%[9].Lina等利用MLPA技術，建立了可以同時檢測10種蜜蜂病毒的高通量篩選技術，取得了較好效果[10].國內史喜菊等人前期研究建立了五種豬病MLPA同步檢測技術[2],在此基礎上，又建立了五種牛病MLPA同步檢測技術[4],后期這兩種檢測技術可以完全融合，實現10種動物疫病的MLPA同步檢測平臺，而且該平臺是開放式的，后期可以隨時加入更多的病原菌。Ehlert等利用了MLPA技術建立了同時檢測10種食品過敏原的高通量技術[11].
這些研究都表明，MLPA技術為疫病的多重檢測提供了一種全新的檢測技術平臺，可用于國內動物疫病疫情的檢測、監測和普查以及相關病原疫苗、檢測試劑病原純度的檢測，也可用于動物源性食品相關病原的檢測。
參考文獻：
[1] Schouten J P,Mc Elgunn C J,Waaijer R,et al. Relativequantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex liga-tion-dependent probe amplification[J].Nucleic Acids Research,2002,30（12）：1-13.
[2] 史喜菊，馬貴平，喬彩霞，等。 多重鏈接探針擴增技術同時檢測五種豬病的研究[J]. 農業生物技術學報，2013,21（6）：745-752.
[3] 韓瀚，劉敬忠，王清濤。 多重連接探針擴增技術的研究進展及其應用[J]. 診斷學理論與實踐，2007,6（4）：380-383.
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[5] 張宏，盛劍秋，耿洪剛，等。 多重連接依賴的探針擴增技術檢測中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌錯配修復基因大片段缺失[J]. 中國醫學科學院學報，2006,28（6）：837- 839.
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[9] Muvunyi C M,Dhont N,Verhelst R,et al. Evaluation of anew multiplex polymerase chain reaction assay STDFinder forthe simultaneous detection of 7 sexually transmitted diseasepathogens[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2011 Sep,71（1）：29-37.
[10] Lina De Smet,Jorgen Ravoet,Joachim R,et al. A versa-tile MLPA-based diagnostic tool for screening bee viruses[J].PLo S One,2012,7（10）： e47953. Doi:10.1371/journal.pone.0047953. Epub 2012 Oct 29.
[11] Ehlert A,Demmel A,Hupfer C,et al. Simultaneous de-tection of DNA from 10 food allergens by ligation-dependentprobe amplification[J]. Food Additive Contamination Part AChemical Analysis Control Expoort Risk Assessment,2009,26（4）：409-418.
