摘 要 隨著固定化酶技術的日新月異，微膠囊技術得到了長足的發展。與傳統微膠囊生產技術不同，文章介紹了一種“天然的”微膠囊固定化酶生產新技術---釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術，詳述了該固定化技術原理及實例。該技術優點在于： 固定化酶的組裝“自然”完成，具有天然抗逆性，大小均一，可重復使用，綠色環保，可實現多種酶的共同固定。最后，對其應用前景進行了展望。
關鍵詞 固定化酶； 微膠囊技術； 釀酒酵母孢子固定化酶； “一孢多酶”法。
固定化酶技術已成為酶工程研究的重點和熱點之一。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩定性，并使酶能夠反復回收利用。微膠囊技術推動了固定化酶的廣泛應用。微膠囊固定化酶采用高分子材料將酶包裹在介質周圍形成微小顆粒，被包裹的物質稱為囊心或芯材，壁殼稱為囊壁或壁材[1].微膠囊固定化酶能夠提供一種特定的反應微環境，使反應物或產物選擇性進入或釋出[2].微膠囊固定化酶最大的特色在于其能將囊內和囊外空間隔離，提高了酶的穩定性，并且可對囊內外的物理化學性質進行有效調控。如今該技術已廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、化工、紡織、生物、農業等領域[3].然而傳統的微膠囊固定化酶技術不足之處在于： 純酶和載體的準備以及對組裝設備的依賴增加了生產成本，尤其是對產量要求不大，但仍需要昂貴設備進行加工的酶微膠囊，其成本更高； 微膠囊顆粒均一性欠佳，產品性能差異較大[4]; 固定化過程產生有害物質[5],給人身安全、環境等帶來隱患； 等等。因而研究探索新的酶固定化技術，開發穩定、高效、生產便利的生產方式，改善微膠囊固定化酶產品性能、降低生產成本、減少生產過程中的資源消耗和環境污染等，是微膠囊固定化酶技術的主要研究內容，符合當今工業綠色環保、可持續發展的要求[6 -7].
對于釀酒酵母孢子的研究很早之前就有報道，但是將孢子應用于酶的固定化卻鮮有報道。近些年來，隨著對釀酒酵母孢子的深入研究[8 -9],孢子的應用領域逐步得到拓寬，釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶（ Saccharomyces cerevisiae spore microencapsulated en-zyme） 技術應運而生。該技術是利用基因工程技術，將可溶性分泌蛋白（ 即目標酶類） 基因在孢子中進行表達，在產孢過程中實現對該蛋白的微膠囊固定化。該技術生產平臺僅需發酵設備，生產規?？筛鶕a品需求量靈活調節?；趯︶劸平湍告咦颖诮Y構的研究，本研究室已經成功實現了多種目標酶類的酵母孢子微膠囊固定化[10 -12].本綜述對釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶（ 以下簡稱孢子固定化酶） 的原理、孢子的組裝過程以及孢子固定化酶的優勢進行詳細闡述，并對其應用前景進行展望。
酵母孢子固定化酶的方法主要有以下兩種： 生物學方法和化學方法。殼聚糖[13]是固定化酶的常用載體，也是野生型酵母孢子壁的重要組成成分，化學方法即通過交聯劑將目標酶固定在“殼聚糖球”上，與目前常用的殼聚糖固定化酶操作基本相似； 不同之處首先是利用孢子形成大小均一、性狀穩定的天然的“殼聚糖球”,然后將目標酶通過理化處理固定在“殼聚糖球”上。因此，本文對化學法孢子固定化酶的原理不做詳細闡述，僅舉例說明。生物學方法是通過基因工程技術，將需要表達的可溶性分泌類酶在孢子形成過程中直接固定在孢子壁中，形成天然的孢子固定化酶微膠囊。該技術的重要物質基礎是孢子壁中的殼聚糖層和二酪氨酸層。以下，將對孢子固定化酶技術的生物學原理及實例進行詳細闡述。
1 釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶原理。
釀酒酵母二倍體細胞在營養豐富的條件下通常進行有絲分裂產生子代個體。在受到環境脅迫時，比如氮源缺乏，會迫使酵母營養細胞從有絲分裂進入減數分裂[14 -18],啟動產孢程序并最終形成一個含有 4個單倍體細胞的子囊，每個單倍體細胞即為孢子。在產孢過程中，形成了前孢子膜這個特殊的膜結構，胞內的分泌系統通過重構，將可溶性分泌蛋白轉運至前孢子膜內； 在前孢子膜內形成孢子壁時，可溶性分泌蛋白被保留在孢子壁內部。雖然，前孢子膜的外膜在孢子壁的組裝過程中消失，但是，成熟的孢子壁仍然能夠將可溶性分泌蛋白截留固定在壁內，這主要是由于殼聚糖層和二酪氨酸層的存在。SUDA 等[19]在孢子壁完整的野生型釀酒酵母孢子內表達分泌型綠色熒光蛋白 GFP 時發現，其能被固定在孢子壁內； 但是缺少了二酪氨酸層的 dit1Δ 孢子卻不能。因此，在孢子中，二酪氨酸層能夠阻擋分泌型蛋白的擴散。
釀酒酵母孢子壁包含有四種形態學上不同的結構層次，從內側到外側依次為甘露糖層（ Mannan） 、β-葡聚糖層（ β-glucan） 、殼聚糖層（ Chitosan） 和二酪氨酸層（ Dityrosine）[9].這 4 層結構的合成是以從內到外的順序依次進行的。比如，最外層二酪氨酸層的合成只有在次外層殼聚糖層合成完畢后才開始合成[20].對于殼聚糖層缺失或其合成有嚴重缺陷的菌株，二酪氨酸層將不能合成。源于孢子壁特有的結構層次，酵母孢子具有高度的抗逆性，比如抗蛋白酶、抗有機試劑、抗熱等[21 -22],因此，在孢子將可溶性分泌蛋白固定在孢子壁的同時也將抗逆性賦予了固定在孢子壁內部的蛋白。酵母孢子產孢過程中可溶性蛋白的分泌表達機制及孢子壁的特殊結構層次，尤其是殼聚糖層和二酪氨酸層的存在是實現孢子固定化酶技術的基礎； 相比于二酪氨酸層，殼聚糖層對于酶的固定更加必不可少。而釀酒酵母營養細胞細胞壁疏松，結構簡單，從內而外依次由 β-葡聚糖層（ β-glu-can） 和甘露糖層（ Mannan） 組成，殼聚糖含量很少，不具備二酪氨酸層，因此對可溶性分泌蛋白的固定比孢子要少很多[10].釀酒酵母孢子壁和營養細胞細胞壁結構如圖 1 所示。
釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術指： 通過分子生物學手段在孢子中表達的可溶性分泌蛋白，在被轉運至孢子外部時經過孢子壁，被孢子壁的某些層次所截留： 一部分鑲嵌在殼聚糖層中，一部分被截留在葡聚糖層和二酪氨酸層之間的空間中； 隨著孢子的成熟，形成了天然、均一、穩定的孢子固定化酶。同時，由于孢子壁最外層二酪氨酸層是網狀半透性膜，大分子物質如蛋白質等不能通過，而小分子物質如底物和產物等可以自由通過，底物與固定在孢子壁內部的酶蛋白結合，從而實現孢子固定化酶對底物的酶解。
關鍵詞 固定化酶； 微膠囊技術； 釀酒酵母孢子固定化酶； “一孢多酶”法。
固定化酶技術已成為酶工程研究的重點和熱點之一。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩定性，并使酶能夠反復回收利用。微膠囊技術推動了固定化酶的廣泛應用。微膠囊固定化酶采用高分子材料將酶包裹在介質周圍形成微小顆粒，被包裹的物質稱為囊心或芯材，壁殼稱為囊壁或壁材[1].微膠囊固定化酶能夠提供一種特定的反應微環境，使反應物或產物選擇性進入或釋出[2].微膠囊固定化酶最大的特色在于其能將囊內和囊外空間隔離，提高了酶的穩定性，并且可對囊內外的物理化學性質進行有效調控。如今該技術已廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、化工、紡織、生物、農業等領域[3].然而傳統的微膠囊固定化酶技術不足之處在于： 純酶和載體的準備以及對組裝設備的依賴增加了生產成本，尤其是對產量要求不大，但仍需要昂貴設備進行加工的酶微膠囊，其成本更高； 微膠囊顆粒均一性欠佳，產品性能差異較大[4]; 固定化過程產生有害物質[5],給人身安全、環境等帶來隱患； 等等。因而研究探索新的酶固定化技術，開發穩定、高效、生產便利的生產方式，改善微膠囊固定化酶產品性能、降低生產成本、減少生產過程中的資源消耗和環境污染等，是微膠囊固定化酶技術的主要研究內容，符合當今工業綠色環保、可持續發展的要求[6 -7].
對于釀酒酵母孢子的研究很早之前就有報道，但是將孢子應用于酶的固定化卻鮮有報道。近些年來，隨著對釀酒酵母孢子的深入研究[8 -9],孢子的應用領域逐步得到拓寬，釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶（ Saccharomyces cerevisiae spore microencapsulated en-zyme） 技術應運而生。該技術是利用基因工程技術，將可溶性分泌蛋白（ 即目標酶類） 基因在孢子中進行表達，在產孢過程中實現對該蛋白的微膠囊固定化。該技術生產平臺僅需發酵設備，生產規?？筛鶕a品需求量靈活調節?；趯︶劸平湍告咦颖诮Y構的研究，本研究室已經成功實現了多種目標酶類的酵母孢子微膠囊固定化[10 -12].本綜述對釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶（ 以下簡稱孢子固定化酶） 的原理、孢子的組裝過程以及孢子固定化酶的優勢進行詳細闡述，并對其應用前景進行展望。
酵母孢子固定化酶的方法主要有以下兩種： 生物學方法和化學方法。殼聚糖[13]是固定化酶的常用載體，也是野生型酵母孢子壁的重要組成成分，化學方法即通過交聯劑將目標酶固定在“殼聚糖球”上，與目前常用的殼聚糖固定化酶操作基本相似； 不同之處首先是利用孢子形成大小均一、性狀穩定的天然的“殼聚糖球”,然后將目標酶通過理化處理固定在“殼聚糖球”上。因此，本文對化學法孢子固定化酶的原理不做詳細闡述，僅舉例說明。生物學方法是通過基因工程技術，將需要表達的可溶性分泌類酶在孢子形成過程中直接固定在孢子壁中，形成天然的孢子固定化酶微膠囊。該技術的重要物質基礎是孢子壁中的殼聚糖層和二酪氨酸層。以下，將對孢子固定化酶技術的生物學原理及實例進行詳細闡述。
1 釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶原理。
釀酒酵母二倍體細胞在營養豐富的條件下通常進行有絲分裂產生子代個體。在受到環境脅迫時，比如氮源缺乏，會迫使酵母營養細胞從有絲分裂進入減數分裂[14 -18],啟動產孢程序并最終形成一個含有 4個單倍體細胞的子囊，每個單倍體細胞即為孢子。在產孢過程中，形成了前孢子膜這個特殊的膜結構，胞內的分泌系統通過重構，將可溶性分泌蛋白轉運至前孢子膜內； 在前孢子膜內形成孢子壁時，可溶性分泌蛋白被保留在孢子壁內部。雖然，前孢子膜的外膜在孢子壁的組裝過程中消失，但是，成熟的孢子壁仍然能夠將可溶性分泌蛋白截留固定在壁內，這主要是由于殼聚糖層和二酪氨酸層的存在。SUDA 等[19]在孢子壁完整的野生型釀酒酵母孢子內表達分泌型綠色熒光蛋白 GFP 時發現，其能被固定在孢子壁內； 但是缺少了二酪氨酸層的 dit1Δ 孢子卻不能。因此，在孢子中，二酪氨酸層能夠阻擋分泌型蛋白的擴散。
釀酒酵母孢子壁包含有四種形態學上不同的結構層次，從內側到外側依次為甘露糖層（ Mannan） 、β-葡聚糖層（ β-glucan） 、殼聚糖層（ Chitosan） 和二酪氨酸層（ Dityrosine）[9].這 4 層結構的合成是以從內到外的順序依次進行的。比如，最外層二酪氨酸層的合成只有在次外層殼聚糖層合成完畢后才開始合成[20].對于殼聚糖層缺失或其合成有嚴重缺陷的菌株，二酪氨酸層將不能合成。源于孢子壁特有的結構層次，酵母孢子具有高度的抗逆性，比如抗蛋白酶、抗有機試劑、抗熱等[21 -22],因此，在孢子將可溶性分泌蛋白固定在孢子壁的同時也將抗逆性賦予了固定在孢子壁內部的蛋白。酵母孢子產孢過程中可溶性蛋白的分泌表達機制及孢子壁的特殊結構層次，尤其是殼聚糖層和二酪氨酸層的存在是實現孢子固定化酶技術的基礎； 相比于二酪氨酸層，殼聚糖層對于酶的固定更加必不可少。而釀酒酵母營養細胞細胞壁疏松，結構簡單，從內而外依次由 β-葡聚糖層（ β-glu-can） 和甘露糖層（ Mannan） 組成，殼聚糖含量很少，不具備二酪氨酸層，因此對可溶性分泌蛋白的固定比孢子要少很多[10].釀酒酵母孢子壁和營養細胞細胞壁結構如圖 1 所示。
釀酒酵母孢子微膠囊固定化酶技術指： 通過分子生物學手段在孢子中表達的可溶性分泌蛋白，在被轉運至孢子外部時經過孢子壁，被孢子壁的某些層次所截留： 一部分鑲嵌在殼聚糖層中，一部分被截留在葡聚糖層和二酪氨酸層之間的空間中； 隨著孢子的成熟，形成了天然、均一、穩定的孢子固定化酶。同時，由于孢子壁最外層二酪氨酸層是網狀半透性膜，大分子物質如蛋白質等不能通過，而小分子物質如底物和產物等可以自由通過，底物與固定在孢子壁內部的酶蛋白結合，從而實現孢子固定化酶對底物的酶解。
