摘要： 載體材料的選擇對固定化酶的性能有著至關重要的影響。 納米復合材料不僅具有納米尺寸的特性，而且可以克服單一材料的不足，在固定化酶領域引起了廣泛關注。 本文就目前在固定化酶領域使用的納米復合載體分類進行了系統的闡述，重點介紹了目前在固定化酶研究領域運用較為廣泛的硅基納米復合材料、 碳基納米復合材料和納米纖維復合材料等材料的制備方法及不同材料對酶學性能的影響，并對這些納米復合材料固定化酶發展前景進行了展望。
關鍵詞： 納米復合材料； 固定化酶； 硅基材料； 碳基材料。
Abstract: The choice of carrier material has a crucial influence on the performance of the immobilized enzyme.
Nanocomposites, which not only have the properties of nanoscale, but also overcome the shortcoming of a singlematerial, have attracted tremendous attention in the field of immobilized enzyme. In this paper, classifications ofnanocomposite carriers which are currently used in the field of immobilized enzyme are systematically elaborated;the preparation and the significantly enhanced enzymology properties of enzymes immobilized on Si-basednanocomposites, C-based nanocomposites and nanofibers composites are introduced. The outlook of enzymesimmobilized on these nanocomposites is also prospected.
Keywords: nanocomposites; immobilized enzyme; Si-based nanomaterials; C-based nanomaterials.
0引 言。
酶是一種可以高效控制特定化學反應的一種通用的生物催化劑，在實際應用中通常將酶作固定化處理。 固定化酶由于其高穩定性、可重用性、易分離等性質被廣泛地應用于化學、生物、農業和醫藥等領域[1-3]. 酶固定化方法主要包括物理吸附法、共價結合法、包埋法和交聯法。 制備固定化酶過程中所采用的固定化技術、載體、介質條件和所催化反應類別會在一定程度上導致酶失活、變性，從而使酶的催化性能或保留活性降低，其中載體所帶來的分配效應、空間障礙效應和擴散限制效應是影響固定化酶催化效率的主要因素，因此探尋可行、有效的固定化載體來增強固定化酶的催化性能一直是固定化酶研究的熱點[4-6].
納米尺度的材料由于具有特殊的表面效應、體積效應、 量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應等，在聲、光、電、磁、熱性能方面呈現出了新的特性，在全球范圍內引起了科學和產業界的極大關注[7]. 與傳統大尺寸材料相比， 納米材料還具有大比表面積、表面易于修飾、與酶分子尺寸相近等優點，作為一種新型的酶固定化載體在生物技術領域得到了廣泛關注[8]. 納米復合材料是由不同性能的納米材料復合而成，可以有效解決單一納米材料固定化酶所面臨的問題，在保持酶活和增強酶的穩定性等方面有較為突出的表現[9]. 本文對近幾年在固定化酶領域所采用的納米復合材料進行了一個系統的分類，并闡述了納米復合材料的結構和制備過程及其各組分對固定化酶性能產生的影響。
1硅基納米復合材料固定化酶研究。
由于高比表面積、高化學純度、高穩定性、化學惰性、 無毒和易于修飾等優良特性， 以二氧化硅（SiO2） 為代表的納米硅基材料已經成為廣泛使用的酶固定化材料[10].
1.1磁性硅基納米復合材料固定化酶。
在空氣或酸性環境下，磁性納米粒子（MNPs）的氧化或溶解會大大限制其使用性能， 且由于 MNP之間存在的磁引力易于聚集而影響分散性能，將MNPs 導入硅基納米材料和將硅基納米材料覆蓋在MNPs 表面形成核殼結構是當前廣泛使用的保護方法。 其中核殼結構納米復合材料具有核殼結構的結合功能和獨特的磁性響應率、低毒性和可化學修飾的表面， 在固定化酶領域具有極大的應用潛力，引起了廣泛關注[11].
介孔二氧化硅（mSiO2）作為已知發展最為成熟、研究最為透徹的介孔材料具有獨特的孔道結構（2~50 nm），不僅有利于大尺寸分子和基團的進入，還因其具有大量納米級孔道而具有納米材料的特性。 同時，mSiO2材料如 MCM-41、MCM-48、SBA-15 和介孔泡沫（MCFs）可以增加酶固定化材料的比表面積、提高酶的穩定性和活性，越來越多的研究者將它作為復合材料的基體來制作酶固定化載體[12-13].
Xie 等[14]首先通過化學共沉淀法獲得磁性納米粒子 Fe3O4,再通過 stober 法在其表面形成介孔材料MCM-41, 從而獲得 Fe3O4@MCM-41 核殼結構納米復合材料（圖 1）， 然后引入氨基官能團并以戊二醛（GA）為交聯劑共價固定褶皺假絲酵母脂肪酶（CRL）。通過透射電子顯微鏡（TEM）圖像分析表明， 具有MCM-41 外殼的復合載體有效地克服了 Fe3O4粒子之間強磁偶極-偶極相互作用。 該法的固定化效率為 76%, 在油脂的 Sn-2 位酯交換反應中保持優良的催化活性和選擇性， 催化效率達到 228.2 U·g-1;重復使用性有所提高，經過 5 次重復使用酶活基本保持不變，飽和磁化強度值為 26.3 emu·g-1,可以通過外加磁場達到簡易分離。 類似的，Zhu 等[15]以羧基功能化 SiO2包裹的磁性納米粒子（Fe3O4@SiO2-NH2-COOH）為載體共價固定豬胰脂肪酶（PPL），用于脂肪酶抑制劑的篩選。 熱重量分析法（TGA）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）表征表明，載體成功羧基功能化且通過酰胺鍵共價固定 PPL 在其表面；振動樣品磁強計（VSM）所得磁滯回線分析表明， 載體 Fe3O4@SiO2-NH2-COOH 和 固定化 PPL 擁有高飽和磁感應強度，分別達到 45.75 和 42.25 emu·g-1,相比未羧基化的 Fe3O4@SiO2（51.51 emu·g-1），磁感應強度略有下降。 固定化 PPL 與游離酶相比，酶活性、可重用性、熱穩定性和儲存穩定性都得到明顯提升，其動力學參數 Km值 從 游 離 酶 的 0.29 mmol·L-1變 為 0.02mmol·L-1,Vmax也從 3.16 U·mg-1·min-1提高到 6.40U·mg-1·min-1, 說明固定化后酶與底物的親和力和催化效率均得到提升。
關鍵詞： 納米復合材料； 固定化酶； 硅基材料； 碳基材料。
Abstract: The choice of carrier material has a crucial influence on the performance of the immobilized enzyme.
Nanocomposites, which not only have the properties of nanoscale, but also overcome the shortcoming of a singlematerial, have attracted tremendous attention in the field of immobilized enzyme. In this paper, classifications ofnanocomposite carriers which are currently used in the field of immobilized enzyme are systematically elaborated;the preparation and the significantly enhanced enzymology properties of enzymes immobilized on Si-basednanocomposites, C-based nanocomposites and nanofibers composites are introduced. The outlook of enzymesimmobilized on these nanocomposites is also prospected.
Keywords: nanocomposites; immobilized enzyme; Si-based nanomaterials; C-based nanomaterials.
0引 言。
酶是一種可以高效控制特定化學反應的一種通用的生物催化劑，在實際應用中通常將酶作固定化處理。 固定化酶由于其高穩定性、可重用性、易分離等性質被廣泛地應用于化學、生物、農業和醫藥等領域[1-3]. 酶固定化方法主要包括物理吸附法、共價結合法、包埋法和交聯法。 制備固定化酶過程中所采用的固定化技術、載體、介質條件和所催化反應類別會在一定程度上導致酶失活、變性，從而使酶的催化性能或保留活性降低，其中載體所帶來的分配效應、空間障礙效應和擴散限制效應是影響固定化酶催化效率的主要因素，因此探尋可行、有效的固定化載體來增強固定化酶的催化性能一直是固定化酶研究的熱點[4-6].
納米尺度的材料由于具有特殊的表面效應、體積效應、 量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應等，在聲、光、電、磁、熱性能方面呈現出了新的特性，在全球范圍內引起了科學和產業界的極大關注[7]. 與傳統大尺寸材料相比， 納米材料還具有大比表面積、表面易于修飾、與酶分子尺寸相近等優點，作為一種新型的酶固定化載體在生物技術領域得到了廣泛關注[8]. 納米復合材料是由不同性能的納米材料復合而成，可以有效解決單一納米材料固定化酶所面臨的問題，在保持酶活和增強酶的穩定性等方面有較為突出的表現[9]. 本文對近幾年在固定化酶領域所采用的納米復合材料進行了一個系統的分類，并闡述了納米復合材料的結構和制備過程及其各組分對固定化酶性能產生的影響。
1硅基納米復合材料固定化酶研究。
由于高比表面積、高化學純度、高穩定性、化學惰性、 無毒和易于修飾等優良特性， 以二氧化硅（SiO2） 為代表的納米硅基材料已經成為廣泛使用的酶固定化材料[10].
1.1磁性硅基納米復合材料固定化酶。
在空氣或酸性環境下，磁性納米粒子（MNPs）的氧化或溶解會大大限制其使用性能， 且由于 MNP之間存在的磁引力易于聚集而影響分散性能，將MNPs 導入硅基納米材料和將硅基納米材料覆蓋在MNPs 表面形成核殼結構是當前廣泛使用的保護方法。 其中核殼結構納米復合材料具有核殼結構的結合功能和獨特的磁性響應率、低毒性和可化學修飾的表面， 在固定化酶領域具有極大的應用潛力，引起了廣泛關注[11].
介孔二氧化硅（mSiO2）作為已知發展最為成熟、研究最為透徹的介孔材料具有獨特的孔道結構（2~50 nm），不僅有利于大尺寸分子和基團的進入，還因其具有大量納米級孔道而具有納米材料的特性。 同時，mSiO2材料如 MCM-41、MCM-48、SBA-15 和介孔泡沫（MCFs）可以增加酶固定化材料的比表面積、提高酶的穩定性和活性，越來越多的研究者將它作為復合材料的基體來制作酶固定化載體[12-13].
Xie 等[14]首先通過化學共沉淀法獲得磁性納米粒子 Fe3O4,再通過 stober 法在其表面形成介孔材料MCM-41, 從而獲得 Fe3O4@MCM-41 核殼結構納米復合材料（圖 1）， 然后引入氨基官能團并以戊二醛（GA）為交聯劑共價固定褶皺假絲酵母脂肪酶（CRL）。通過透射電子顯微鏡（TEM）圖像分析表明， 具有MCM-41 外殼的復合載體有效地克服了 Fe3O4粒子之間強磁偶極-偶極相互作用。 該法的固定化效率為 76%, 在油脂的 Sn-2 位酯交換反應中保持優良的催化活性和選擇性， 催化效率達到 228.2 U·g-1;重復使用性有所提高，經過 5 次重復使用酶活基本保持不變，飽和磁化強度值為 26.3 emu·g-1,可以通過外加磁場達到簡易分離。 類似的，Zhu 等[15]以羧基功能化 SiO2包裹的磁性納米粒子（Fe3O4@SiO2-NH2-COOH）為載體共價固定豬胰脂肪酶（PPL），用于脂肪酶抑制劑的篩選。 熱重量分析法（TGA）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）表征表明，載體成功羧基功能化且通過酰胺鍵共價固定 PPL 在其表面；振動樣品磁強計（VSM）所得磁滯回線分析表明， 載體 Fe3O4@SiO2-NH2-COOH 和 固定化 PPL 擁有高飽和磁感應強度，分別達到 45.75 和 42.25 emu·g-1,相比未羧基化的 Fe3O4@SiO2（51.51 emu·g-1），磁感應強度略有下降。 固定化 PPL 與游離酶相比，酶活性、可重用性、熱穩定性和儲存穩定性都得到明顯提升，其動力學參數 Km值 從 游 離 酶 的 0.29 mmol·L-1變 為 0.02mmol·L-1,Vmax也從 3.16 U·mg-1·min-1提高到 6.40U·mg-1·min-1, 說明固定化后酶與底物的親和力和催化效率均得到提升。
