<td id="nvp8e"><strike id="nvp8e"></strike></td>
    <td id="nvp8e"><ruby id="nvp8e"><mark id="nvp8e"></mark></ruby></td>
  1. <acronym id="nvp8e"><label id="nvp8e"></label></acronym>
    <acronym id="nvp8e"><label id="nvp8e"></label></acronym>

      藏刊網,職稱文章發表、期刊投稿權威機構

      投稿咨詢

      投稿在線咨詢

      專著咨詢

      合著&獨著&編委

      編輯在線咨詢

      專利咨詢

      專利申請&轉讓

      編輯在線咨詢

      軟著版權

      軟著版權

      編輯在線咨詢

      在線溝通

      論文&專著&專利

      編輯在線咨詢

      微信聊

      微信掃一掃

      首頁 > 科學論文 > > 質粒抽提策略對雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳彌散的影響
      質粒抽提策略對雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳彌散的影響
      >2024-05-12 09:00:00


      雙酶切聯合瓊脂糖凝膠電泳是鑒定 DNA 重組成功與否的重要方法[1],瓊脂糖凝膠電泳圖像質量直接影響鑒定結果的判讀、論文發表。條帶彌散是圖像質量不佳的主要表現之一,研究者多將其歸咎于不合理的酶切和不規范的電泳操作[2],而很少報道質粒抽提策略對彌散的影響。筆者在雙酶切鑒定葡萄糖6 - 磷酸脫氫酶(glucose 6-phosphate dehydro-genase,G6PD)重組質粒 pET-28a-G6PD 時,發現質粒抽提策略對雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳彌散有顯著影響,現報道如下,以供參考。

      1 材料與方法

      1. 1 質粒與菌株

      含空質粒 pET-28a 的大腸桿菌 Top10 (pET-28a / Top10)由本教研室保存。重組質粒 pET-28a-G6PD 為筆者構建并轉化至 Top10 感受態細胞中。

      1. 2 試劑與儀器

      質粒小量提取試劑盒、卡那霉素、50 × TAE 電泳緩沖液購自上海生工生物工程有限公司,快速限制性核酸內切酶為 Fermentas 公司產品,瓊脂糖為Biowest 公司產品。酵母浸出粉、胰蛋白胨為 OXIOD公司產品。MilliQ 超純水為 實 驗 室 自 制。DNAmarker 為 TAKARA 公司產品。POWER Pac HC 高電流電源為 BIO-RAD 公司產品、GIS 凝膠成像儀為上海天能公司產品,DYCP-31DN 型電泳槽為北京六一儀器廠產品。

      1. 3 菌液培養

      將含 pET-28a 和 pET-28a-G6PD 的大腸桿菌Top10 分別劃線于含 100 μg / ml 卡那霉素的 LB 平板中,37 ℃倒置培養 15 h.挑單菌落各 1 個,接種至 40 ml(裝于 250 ml 三角瓶中)含 50 μg/ml 卡那霉素的 LB 中,于搖床內 37 ℃ 250 r/min 培養,用上述不含菌液的 LB 作為空白對照,用可見分光光度計測定 600 nm 處的菌液的光密度值(OD600),至OD600為 1. 6,停止培養。

      1. 4 取

      1. 4 ml 菌液抽提質粒

      利用質粒小量提取試劑盒抽提質粒。步驟如下:①分別從各瓶吸取菌液 1. 4 ml 至 1. 5 ml 管心管,室溫 10 000 r/min,離心 30 s,棄上清;②加 250μl 溶液 P1,3 000 r/min 渦旋 1 min;③加 250 μl 溶液 P2,溫和顛倒混勻 10 次,室溫靜置 4 min;④加入350 μl 溶液 P3,溫和顛倒混勻 10 次;⑤室溫 12 000r / min 離心 6 min;⑥取 750 μl 上清于另一 1. 5 ml 離心管,室溫 14 000 r/min 離心10 min;⑦取600 μl 上清于吸附柱中,室溫 9 000 r/min 離心 30 s;⑧棄濾液,向吸附柱中加500μl WD1,室溫10 000 r/min 離心 1 min;⑨棄濾液,向吸附柱中加 500 μl wash buff-er,室溫 10 000 r / min 離心 1 min;⑩重復⑨一次;瑏瑡\ue583棄濾液,將吸附柱置于收集管中,室溫 13 000 r/min離心 2 min;瑏瑢\ue583將去蓋的吸附柱置于滅菌的 1. 5 ml離心管,做好標記,向吸附柱中加入 80μl 滅菌超純水,室溫靜置 2 min,13 000 r/min 離心 1 min,收集濾液,冰浴備用。

      1. 5 取 2 × 0. 7 ml 菌液抽提質粒

      分別從各瓶取菌液0. 7 ml 至1. 5 ml 離心管,平行抽提兩份,按1. 4① - ⑥抽提質粒,將⑥后的兩份平行抽提的上清各600 μl 收集于1. 5 ml 離心管,于同一吸附柱內分兩次進行⑦,后續步驟與 1. 4 相同。

      1. 6 取 4 × 0. 35 ml 菌液抽提質粒

      分別從各瓶取菌液0.35 ml 至1.5 ml 離心管,平行抽提四份,按 1. 4 中① - ⑥抽提質粒,將⑥后的四份平行抽提的上清各 600 μl 收集于 5 ml 離心管,于同一吸附柱內分4 次進行⑦,后續步驟與1.4 相同。

      1. 7 質粒的雙酶切反應

      1. 4 ml,2 × 0. 7 ml,4 × 0. 35 ml 菌液抽提的pET-28a 經 NanoDrop 2000 測定濃度分別為 116,125,130 ng / μl;pET-28a-G6PD 的濃度分別為 120,134,145 ng /μl.用滅菌超純水將所有質粒稀釋至116 ng / μl.酶切體系:空質粒( 或重組質粒) 1 μg,Nde Ⅰ、Xho Ⅰ各 1 μl,10 × FD Green Buffer 2 μl,加水至 20 μl.混勻,37 ℃酶切 1 h.

      1. 8 雙酶切質粒的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

      配制 1. 2% 的瓊脂糖凝膠。將 2 μl 1 kb DNAladder marker(與 13 μl 1 × TAE 及 3 μl 6 × LoadingBuffer 混勻)、雙酶切的 pET-28a、雙酶切 pET-28a-G6PD 全量加入上樣孔,130 V 電泳 30 min.

      1. 9 質粒純度的測定

      利用 NanoDrop 2000 測定三種策略抽提的質粒pET-28a 和 pET-28a-G6PD 的 OD260、OD280值,評估質粒純度。1. 3 - 1. 9 的實驗進行 4 次重復(獨立實驗)。

      2 結果

      2. 1 雙酶切后的質粒電泳圖譜

      按策略 1. 4,1. 5,1. 6 抽提的質粒酶切后電泳圖譜見圖1.可知,按1. 4 策略抽提的質粒 pET-28a 和pET-28a-G6PD 雙酶切后均嚴重彌散,盡管第 2 泳道中酶切產生的大片段(略大于5 000 bp)、小片段(介于1 000 -2 000 bp)分別與 pET-28a(5 239 bp)、G6PD分子量(1 548 bp)相符,但其相對亮度與理論不符;按1.5 策略抽提的 pET-28a 酶切后在 <1 000 bp 范圍內彌散明顯減少,pET-28a-G6PD 酶切后的彌散有明顯改善,大片段的亮度明顯高于小片斷;按 1. 6 策略抽提的 pET-28a 和 pET-28a-G6PD 酶切后的彌散幾乎完全消失,pET-28a-G6PD 酶切產生的大、小片段亮度比值接近理論值。

      2. 2 質粒純度測定

      策略1. 4,1. 5,1. 6 抽提的質粒 pET-28a 和 pET-28a-G6PD 的 4 次實驗的 OD260/ OD280平均值分別為1. 36 和 1. 45,1. 65 和 1. 70,1. 75 和 1. 78.可見,菌液越少,質粒的純度越高,所含蛋白雜質越少。

      3 討論

      質粒的雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳的原理簡單,易于掌握;但要獲得理想的瓊脂糖凝膠電泳圖片,需要在多個環節上下功夫。導致電泳圖片效果不佳的原因很多,有些無法從文獻找到答案,需根據具體情況分析,并用實驗檢驗。酶切后彌散是瓊脂糖凝膠電泳常見的實驗現象之一,導致彌散的原因有:①質粒 DNA 中含有 DNase,在酶切緩沖液的 Mg2 +作用下激活,水解質粒[3].②不正確的酶切,如酶用量過多、酶切時間過長、酶切緩沖液錯誤,導致質粒被切碎。③不合理的電泳緩沖液,如緩沖液陳舊、緩沖液配制錯誤(如 pH 和鹽離子濃度錯誤)。④瓊脂糖凝膠配制錯誤。

      本研究所用菌株 Top10 為 end A (編碼非特異性 DNA 內切酶Ⅰ)突變型,同時溶解質粒的超純水均為滅菌后一次使用,可排除 DNA 酶對質粒的降解。隨著優質的限制性內切酶及其通用緩沖液的出現,酶切操作極為簡便,不正確酶切發生的概率很小。即用型商品化電泳緩沖液的推出,極大減少了因緩沖液和瓊脂糖配制錯誤所致的彌散。為此,筆者推測電泳彌散與上述四個原因無關,可能是質粒純度低所致。

      雖然試劑盒法提取質粒速度快、純度高[4],但仍有不少細節需要在操作時注意。如說明書要求取過夜培養的菌液 1. 5 - 5 ml 用于質粒的抽提,其中過夜培養是一個模糊時間,8 - 16 h 均可認為是過夜培養,不同過夜培養時間導致的菌液濃度相差懸殊。此外接種時菌落的生長狀態和大小,以及菌株的生長速度均會導致相同培養時間菌液濃度不一。

      故需要摸索菌液用量,調整抽提策略,而不能"盡信書".在按照 1. 4,1. 5,1. 6 的策略抽提時,發現向1. 4 ml 菌液所含菌體中加入溶液 P2 裂解后,需要在顛倒混勻后靜置 4 min,菌體才變為透明的溶液;用 0. 7 ml 或 0. 35 ml 菌液抽提質粒時,加入溶液 P2顛倒混勻后,立即變為澄清溶液,無需靜置,且三種策略裂解的菌液澄清度依次增加。如只取 1. 4 ml菌液抽提質粒,不進行菌液用量的比較,很容易認為1. 4 的透明溶液就是澄清溶液,就繼續后續的操作步驟。

      如不測定質粒純度,貿然進行酶切操作,極易導致酶切鑒定圖片質量不佳,甚至導致無法觀察到酶切產生的目的條帶,嚴重影響結果的判斷。同時,不純的重組質粒嚴重影響測序[5].純度測定表明,等量的菌液分成小份多次抽提所得到的質粒純度逐步提高,酶切后電泳彌散現象逐步消失。其原因可能是分次抽提時,菌體充分裂解,蛋白和基因組 DNA充分變性,在加入溶液 P3 后變性的蛋白和基因組DNA 沉淀更完全,故蛋白質和基因組 DNA 污染減少;同時因裂解單位質量的菌體所用的溶液 P1(含有 RNA 酶)增多,RNA 也清除得更徹底。

      總之,通過本文的研究,筆者發現采用雙酶切聯合瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質粒時,質粒的抽提策略對酶切后瓊脂糖凝膠電泳彌散有顯著影響。用過多的菌液抽提質粒,因裂解不充分,導致菌體蛋白等雜質難以去除,所提質粒純度低,易導致雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳彌散。

      參考文獻:
      [1] 蔣俊豪,賀修勝。 PCR - 雙酶切鑒定 STGC3 抑癌基因重組子假陽性研究[J]. 現代生物醫學進展,2007,7(6):819 -823.
      [2] 曹秀華,王亞婷,李麗,等。 瓊脂糖凝膠電泳的條件優化-質粒DNA 重組片段的限制性內切酶譜鑒定[J]. 齊齊哈爾醫學院學報,2011,32(01):9 -11.
      [3] 薩姆布魯克 J,拉賽爾 DW. 分子克隆實驗指南[M]. 3 版。 黃培堂,譯。 北京:科學出版社,2002:35.

      綜合排序
      投稿量
      錄用量
      發行量
      教育界

      主管:廣西壯族自治區新聞出版局

      主辦:廣西出版雜志社

      國際:ISSN 1674-9510

      國內:CN 45-1376/G4

      級別:省級期刊

      中國報業

      主管:中國報業協會

      主辦:中國報業協會

      國際:ISSN 1671-0029

      國內:CN 11-4629/G2

      級別:國家級期刊

      中國房地產業

      主管:中華人民共和國住房部和...

      主辦:中國房地產業協會

      國際:ISSN 1002-8536

      國內:CN 11-5936/F

      級別:國家級期刊

      建筑與裝飾

      主管:天津出版傳媒集團有限公司

      主辦:天津科學技術出版社有限...

      國際:ISSN 1009-699X

      國內:CN 12-1450/TS

      級別:省級期刊

      財經界

      主管:國家發展和改革委員會

      主辦:國家信息中心

      國際:ISSN 1009-2781

      國內:CN 11-4098/F

      級別:國家級期刊

      文化月刊

      主管:中華人民共和國文化部

      主辦:中國文化傳媒集團有限公司

      國際:ISSN 1004-6631

      國內:CN 11-3120/G2

      級別:國家級期刊

      期刊在線投稿系統
      上傳文件
      支持上傳.doc、.docx、.pdf文件
      18年國內外學術服務,發表國際文獻請認準藏刊網官網

      資深編輯團隊

      專業設計投入方案

      投稿成功率極高

      企業信譽保障

      對公交易更安全

      人民群眾口碑好

      高效投稿流程

      審稿快!出刊快!檢索快!

      正規刊物承諾

      無假刊!無套刊!

      投稿成功!

      藏刊網提醒您

      1.稿件將進入人工審稿階段,審稿后會有編輯聯系您,請保持手機暢通。

      2.為避免一稿多投、重刊等現象影響您的發表,請勿再投他刊。

      確定

      投稿失??!

      藏刊網提醒您

      由于網絡問題,提交數據出現錯誤,請返回免費投稿頁面重新投稿,謝謝!

      確定

      藏刊網收錄400余種期刊,15年誠信發表服務。

      發表職稱文章,覆蓋教育期刊、醫學期刊、經濟期刊、管理期刊、文學期刊等主流學術期刊。

        投稿郵箱:cangkan@163.com

      本站少量資源屬于網絡共享如有侵權請您聯系我們,將在第一時間刪除。

      版權 2009-2022 版權所有:河北藏刊文化發展有限公司 工信部備案:ICP備20016223號 冀公網安備13010502002858號

      人妻偷人精品免费视频|热区欧美精品亚洲高清区|亚洲国产精品狼友在线观看|久久精品视香蕉蕉|国产免费第一区二区三区