硒是人體所必需的一種微量元素，它能提高人體的免疫力，并能預防許多種疾病，在機體中它有重要的生理作用[1-3],硒是谷胱甘肽過氧化酶、5. -脫碘酶的必需組成部分，同時又是體內許多蛋白質的組成成分，對動物機體抗氧化、抗應激、提高免疫力等起著重要的作用。隨著人們對硒研究的深入，硒對動物機體的重要作用越來越受到重視。
世界衛生組織公布的資料表明，全世界有 40多個國家和地區不同程度的缺硒，我國 2/3 的地區屬于缺硒地區，29. 00% 的地區嚴重缺硒[4].已經證明，硒的形態是影響生物對其吸收和利用的重要因素。無機亞硒酸鈉毒性高，且動物對無機硒吸收利用率不高，而人的安全膳食硒攝入量為 50 ~ 500μg/d,與中毒劑量 （750 μg/d） 相差范圍小，故以亞硒酸鈉作為動物及人體補硒的直接硒源，其風險大; 生物大分子結合態有機硒安全、生物活性好、吸收率較高，所以有機硒補劑產品的開發和研究受到了廣泛關注。由于有機硒的基本存在形式為硒蛋白。
硒僅以硒半胱氨酸（selenocysteine,SeCys） 和硒蛋氨酸（selenomethionine,SeMet） 兩種形式共價結合在蛋白質中[5].因此，在人們的補硒過程中必須關注量的問題，在富硒食品、藥品、營養品和保健品的開發研制過程中對產品硒含量和硒形態的檢測顯得尤為重要。測定有機硒的手段很多，不同的提取過程和測定方法，其靈敏度和適用范圍各不相同，對近年來國內外有機硒硒蛋白中硒代氨基酸的形態檢測方法進行了綜述。
1 硒形態樣品的提取
在水解過程半胱氨酸殘基的側鏈琉基不穩定，易斷裂，因此選擇適合的提取方法是測定硒蛋白中硒代氨基酸含量的關鍵[6].
在小分子硒形態方面，主要包括水提取法、酸提取法和酶提取法[7].水提取對一些非結合蛋白形式的硒形態較適合，如硒 - 甲基硒代半胱氨酸、γ - 谷氨?；?- 硒甲基硒代半胱氨酸，但對以蛋白形式結合的硒，回收率較差； 酸提取法有很高的回收率，但酸易使硒形態發生轉變。
早在上世紀五十年代，就有人對硒氨基酸的水解進行研究，Whitchead 認為在除氧傳統酸水解條件下，硒蛋氨酸穩定，1961 年，Blau 指出硒蛋氨酸（seMet） 在 6mol/L Hcl、110℃、7h 水解中幾乎全部被破壞； 1969 年，Shepherd 也得到同樣的結論。顯然，這是兩個矛盾的結論。1981 年，Beilstein 認為在惰性氣氛中，游離態的硒半朧氨酸的回收率常量、微量達到 80. 00% ~90. 00%,但此結論是否適合硒蛋白中結合態硒氨基酸還有待進一步確證。1985 年，劉曼西卿認為改變傳統水解法，采用低酸度、低溫度、長時間條件，可提高硒氨基酸的回收率，1986年，Syliva 等認為加入還原劑并通 N2,可提高硒蛋白的穩定性； 1988 年，謝麗琪、歐陽政在上述基礎上提出除氧改良水解法，該法對結合態硒蛋氨酸的回改率達 84. 00%.
Gergely 等[8]分析雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 、香菇中的硒形態時，比較了 3 種蛋白質提取方案（0. 1mol/L NaOH,30mmol/L Tris - Hcl 緩沖液，酶消解） 的效果，發現 24h Tris - Hcl 緩沖液提取，加入丙酮的方法提取水溶態的含硒蛋白質效果最好； 在利用酶體系進行消解時，胰蛋白酶在 50℃的條件下處理 24 h 可以達到比較高的降解和提取效率。同樣是分析富硒雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 中的硒形態，Stefa'nka 等[9]采用三步提取法（水提取，胃蛋白酶提取，胰蛋白酶提?。?對樣品中的硒進行浸提，提取效率達到 75%; 用高效液相色譜和水力高壓霧化器連用對浸提液進行分析，成功檢測出 SeCys2 和 Se（Ⅳ） ,檢出限達到 0. 25 mg/L.
酶提取法的應用最廣（表 1） ,常用的酶有蛋白酶 K,蛋白酶 XIV,胰蛋白酶，胃蛋白酶和鏈霉蛋白酶等。酶提取法通常在溫和的條件下（37℃，pH7. 0） 進行，可以減少硒形態之間相互轉化，但此法提取的時間較長，一般需 24 ~48 h.Emese 等[10]對富硒北蔥硒形態分析采用 2 種方法進行提取 : ①對于非蛋白硒 ,用高氯酸 - 乙醇（8∶ 2） 提??； ②對于蛋白硒，采用酶解法。首先蛋白酶 K 溶于 pH 7. 5的三羥甲基氨基甲烷（Tris） 緩沖液（包含 1 mmol/L- 1 氯化鈣 2） ,所得到的溶液加入到韭菜樣品中，在 50 ℃下攪拌 15 h,后再加入蛋白酶 XIV,同樣在50 ℃ 下攪拌 15 h.在第 1 種提取方法下 ,檢測到MeSeCys,SeCys2,Se （Ⅳ） 和 Se （Ⅵ） 等 4 種硒形態，用第 2 種提取方法，檢測到 5 種硒形態（多檢測出 SeMet） ,且酶解法得出的有機硒形態含量高于第1 種方法。
按照使用輔助儀器的不同，分為萃取提取、振搖提取、超聲提取、離心提取、微波提取等，其中超聲微波結合酶提取法可以有效地縮短提取時間[18],加壓液體萃取法（PLE） 是未來研究的方向之一。該方法在分析錫和砷形態分析上得到應用，但在硒形態分析上應用較少[19].
2 硒形態分離技術
2. 1 氣相色譜法 氣相色譜法（GC） 測定硒及硒的化合物，需要將其衍生成揮發性的有機硒化合物，然后經過萃取和色譜兩次分離，消除共萃取物的干擾，同時結合高靈敏度和高選擇性檢測器，可以準確地對硒的形態進行定性和定量。氣相色譜可以用來分離揮發性的二甲基硒、二甲基二硒； 如果分離硒氨基酸需要用衍生法增加其揮發性。Beril 等[20]用 GC - MS 進行硒酵母中硒的形態分析時，用氯甲酸乙酯衍生法分離、測定富硒酵母中的硒蛋氨酸、硒半胱氨酸，試驗證明該法能夠迅速、有效地分離、測定兩種氨基酸。目前已用于食品強化劑中硒化合物的測定。
2. 2 毛細管電泳法 毛細管電泳（CE） 以其分離效率高，樣品用量少，無填充物影響目標化合物穩定性等優點，大量用于硒化物的分離。目前發展的毛細管電泳方法有： 毛細管區帶電泳（CZE） ,毛細管等電聚焦（CIEF） ,毛細管電色譜（CEC） ,毛細管凝膠電泳（CGE） 等方式[21]而其中毛細管區帶電泳進行形態研究較多的一種元素是硒，可通過調整毛細管內壁涂層和電解質的組成來改善分離效果。
毛細管電泳與紫外和可見光檢測已用于金屬硫蛋白的分離。Sasi[22]等用毛細管電泳的方法分離巴西干果提取液中的各種含硒物質，ICP - MS 檢測，在7 min 內分離出亞硒酸、硒酸、硒胱氨酸和硒蛋氨酸。
2. 3 液相色譜法 目前在硒形態分析方法學的研究中，高效的動態分離技術與高靈敏的檢測技術聯合使用占據了主要地位。作為高效的分離技術，液相色譜（HPLC） 在硒形態分析中得到廣泛的應用，是迄今為止硒形態分析中使用最多的分離方法。
HPLC 分離技術有尺寸排阻色譜（SELC） 、離子色譜（IC） 、離子交換色譜（IE） [包括陰離子（AE） 和陽離子（CE） ]、手性色譜 CLC） 和反相色譜（RPLC） .尺寸排阻色譜（SELC） 主要應用于硒蛋白、硒多糖的檢測以及硒與蛋白相互作用的研究中。鐵梅等[23]分別采用 SEC - HPLC - ICP - MS 和 RP - HPLC - ICP- MS 技術對富硒金針菇中的含硒化合物進行分析，確定了富硒金針菇中含有硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸和由二者組成的含硒多肽等，各形態硒的含量分別為總硒量的 12. 30%、17. 60% 和 36. 80%.IE 和RPLC 主要應用于 Se（Ⅳ） 、Se（Ⅵ） 、硒蛋氨酸和硒半胱氨酸等含硒氨基酸的分離[24].仲娜等采用離子對試劑對海帶中硒的形態進行反相液相色譜分離，不需柱前衍生化即可有效提高樣品分離效率，且條件適于 ICP - MS,采用 C18 柱分離，柱效高，峰形尖銳，保留時間長，可分離出亞硒酸鈉、硒甲基半胱氨酸（MeSeCys） 、硒代蛋氨酸（SeMet） 三種形態，分離效果好[16].Zheng 等使用含混合離子對試劑（2. 5mmol/L 丁基磺酸鹽，8mmol/L 四丁基氫氧化銨、4 rnmol/L/丙二酸、0. 05% 甲醇） 的流動相對硒形態進行分離，此混合離子對試劑可同時分離陽離子、陰離子和電中性的多種硒形態[25].韋昌金等采用 PRP - X100 陰離子交換分析柱可以在 10 min 內同時分離出 4 種 As 形態和 3 種 Se 形態[26].反相色譜分離模式中組分的洗脫順序與其和固定相之間的疏水性作用的強弱相一致。Gomez - Ariza 等采用甲醇和水作流動相在 C18 反相柱上成功分離了硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代乙硫氨酸[27]
.Susan等[28]通過柱前衍生將硒代氨基酸進行轉化，進而用反相色譜成功地分離了 3 種硒代氨基酸，獲得了比離子交換分離模式更高的柱效。
高效液相色譜、毛細管電泳以及氣相色譜是目前研究較多且應用較為廣泛的 3 種分離技術。其中又以高效液相色譜法的應用最多，根據實際樣品的特點研究人員選擇合適的色譜體系，按照某種色譜分離模式對化合物實現分離以及檢測。
3 硒形態檢測技術
硒的檢測方法很多，如光度法，催化動力學法，極譜法，熒光法[29,30],伏安法等，目前，運用電感耦合等離子體質譜，原子熒光測定硒的報道較多。
3. 1 電感耦合等離子體質譜法（ICP - MS） 電感耦合等離子體質譜法（ICP - MS） 是上世紀 80 年代發展起來的一種理想的多元素同時檢測技術，雖然該技術靈敏度高在微量元素分析中具有獨特的優越性。然而，對于 Se 元素，ICP - MS 的檢測能力卻大為遜色，這主要是因為 Se 元素具有較高的電離能（9. 75eV） ,在氬等離子體中電離程度較低，所以靈敏度較差。這些問題的存在嚴重制約了普通型 ICP- MS 檢測硒的靈敏度和準確性。ICP - MS 分析中常采取的減少干擾的方法主要有以下幾種： ①選擇多個同位素同時監測； ②應用動態碰撞池或者反應池系統，通過反應氣體與多原子離子進行碰撞或反應再選擇性地消除多原子離子的干擾； ③采用高分辨的雙聚焦質量分析器； ④應用可調離子氣源，低壓ICP（L P2ICP） 、微波誘導等離子體（MIP） 和輝光放電（GD） 用氦氣作為等離子體氣，可以避免氬的聚合物的光譜干擾。高效液相色譜（HPLC） 和電感耦合等離子體質譜（ICP - MS） 聯用是發展較為完善的技術之一。HPLC - ICP - MS 聯用分析技術是以各種不同的色譜分離柱完成不同種類樣品分析物的分離，以高靈敏度的 ICP - MS 擔任信號檢出，具有元素專一性、線性范圍寬和檢測限低等特點，是具有高靈敏度和高選擇性的形態分析系統，而且形態分析時不需要復雜的樣品前處理和復雜的接口，只需HPLC 的流速和 ICP - MS 的進樣速度相匹配，近年來在元素形態分析中已得到廣泛的應用。HPLC -ICP - MS 的聯用及其在元素化學形態分析中的應用已有許多文獻總結。
高分辨能力的色譜技術和強鑒定能力的質譜技術的結合在微量有機硒化合物的分析測定中得到充分應用。Kyoden 等[31以水解蛋白酶消解，凝膠柱色譜和薄層色譜分離，GC - MS 測定了大豆蛋白中的硒蛋氨酸。Christoph 等[32]用反相 HPLC 分離結合 ICP - MS 測定了硒胱氨酸、硒蛋氨酸、硒胱胺、硒乙硫基氨基酪酸，并討論了流動相的組成、pH 以及樣品的 pH 和吸入速度。檢出限分別為 0. 008ng/ml、0. 016ng / ml、0. 009ng / ml、0. 18ng / ml.Michalk[33]用毛細管電泳分離結合 ICP - MS 測定了人奶、血漿中 Se（Ⅳ） 、Se（Ⅵ） ,檢出限為10. 0 Lg/L.
3. 2 原子熒光測定法 原子熒光分光光度法和原子吸收分光光度法比較成熟、簡單易行、使用普遍，所以在很多聯用技術中多有使用。Amit 等[34]用直接氫化物發生原子吸收方法檢測人尿中的硒蛋氨酸，檢測限是1. 08 μg/L,校準曲線在0 ~30 μg/L 范圍內呈線性相關。
4 展 望
目前硒元素形態分析已經有了一定的發展，多種技術聯合使用是硒形態分析的主流，高效連接各種分離方法和檢測系統的結構技術是研究的焦點。由于硒在實際樣品中存在的多樣性和復雜性，還需要繼續挖掘現有結構鑒定技術的潛力，合成提供更多不同硒形態的標準物質。方法的實用化和標準化是聯用技術真正應用于硒形態分析的必要步驟。
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