人高密度脂蛋白結合蛋白（HDLBP）-VIGILIN蛋白是一種含有14個相關、但不完全相同的串聯的KH結構域的多功能蛋白質，VIGILIN蛋白在細胞核和細胞質中均有分布[1].VIGILIN蛋白家族廣泛存在于真核生物中，如果蠅中的DDP1、酵母中的Scp160、脊椎動物中的VIGILIN蛋白。不同生物種類中的VIGILIN蛋白結構和功能具有高度的保守性[2,3].人VIGILIN基因位于2q37,其包含29個外顯子，主要編碼相對分子質量為150×103的VIGILIN蛋白。目前有研究報道VIGILIN蛋白有多種生物學功能，包括參與脂代謝[4]、有絲分裂時異染色質的分離、維持異染色質結構的穩定性[5],幫助tRNA在細胞質和細胞核間的轉運、維持mRNA的穩定性[6],參與印記基因IGF2/H19的調控[7],與肝癌、乳腺癌等的發生、發展有關[8,9].
本研究根據人VIGILIN蛋白不同的結構域將VIGILIN全長分成5個片段，并且將5個片段分別亞克隆到pGEX 5X3原核表達載體中，采用pGEX原核表達系統在大腸桿菌中誘導表達，產生大量GST融合蛋白，為進一步研究VIGILIN與其他蛋白的相互作用打下基礎。
1材料與方法
1.1實驗材料2×Taq Plus Master Mix購自上海近岸科技有限公司，Pyrobest DNA Polymerase購自大連寶生物公司，質粒小量提取試劑盒購自Omega公司，DNA凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司，限制性內切酶及DNA連接酶購自Formentas公司，IPTG、瓊脂糖購自Invitrgen公司，引物合成及質粒測序鑒定由Invitrogen公司完成。含VIGILIN全長cDNA序列的pDsred2-N1/VIGILIN重組質粒由我室構建，原核表達載體pGEX 5X3由劉建余博士饋贈，大腸桿菌BL21、DH5α為本室保存。
1.2 VIGILIN分段及引物設計根據人VIGILIN蛋白不同的結構域將VIGILIN全長cDNA（GenBankNM_005336.4）分成5個片段，分別為N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端，并用primer軟件設計包括全長在內的6對引物，分別在引物兩端加上合適的酶切位點及酶切位點相應的保護堿基，送至Invitrogen公司合成。
為了糾正與GST融合表達后可能出現的讀碼框移位，設計及合成引物時在VIGILIN全長cDNA起始密碼上游引入2個堿基，在N端、KH13-14、C端端上游引入2個堿基，在KH1-7、KH8-12上游引入1個堿基，以使GST和VIGILIN都能在正確的讀碼框內融合表達。分段擴增VIGILIN片段的引物序列、位置、酶切位點等見附表。
1.3 VIGILIN全長及分段cDNA PCR擴增以pDsred2-N1/VIGILIN重組質粒為模板擴增VIGILIN全長cDNA及分段cDNA.
VIGILIN全長PCR擴增的反應體系為：10×Pyrobest buffer 5μL,dNTP Mix（各2.5mmol/L）4μL,上游引物（10pmol/L）1μL,下游引物（10pmol/L）1μL,模板0.5μL（約50ng），Pyrobest酶（5U/μL）0.5μL混勻，水36.5μL,反應總體積為48.5μL[10].
VIGILIN全長擴增條件為：預變性94℃，5min,變性94℃，45s,退火58℃，30s,延伸72℃，3min,30個循環后4℃保存。
VIGILINN端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端PCR擴增體系為：2×Taq Plus Master Mix25μL,上游引物（10pmo l/L）1μL,下游引物（10pmol/L）1μL,模板0.5μL（約50ng），水22.5μL,反應總體積為50μL.VIGILIN分段擴增條件為：預變性94℃，1min 30s,變性94℃，30s,退火溫度見附表，30s,延伸72℃，1min,30個循環后72℃延伸5min后4℃保存。各段均以相應體系和相應條件分別擴增4管，共200μL.分別取各段擴增產物5μL,15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定后各段剩余PCR產物均用15g/L瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段。
1.4 VIGILIN全長及分段cDNA原核表達載體構建分別雙酶切VIGILIN各片段及pGEX 5X3質粒。各片段所用限制性內切酶分別為SmaⅠ/XhoⅠ（VIGILIN全長），BamHⅠ/EcoRⅠ（N端），EcoRⅠ/XhoⅠ（KH1-7），EcoRⅠ/XhoⅠ（KH8-12）,BamHⅠ/XhoⅠ（KH13-14），BamHⅠ/EcoRⅠ（C端）。pGEX 5X3質粒用相同的限制性內切酶雙酶切。將酶切后的各片段用15g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收。分別將純化的目的片段與純化的相應的pGEX 5X3載體連接，VIGILIN分段的連接體系為：10×T4DNA ligase buffer 2μL,T4DNA ligase（5U/μL）0.2μL,pGEX5X3載體20ng,目的片斷60~200ng,總體積20μL.
22℃連接1h.VIGILIN全長因引入了SmaⅠ,所以按平末端的方法連接，體系為:0×T4DNA ligasebuffer 2μL,50%PEG 4000Solution 2μL,T4DNA ligase（5U/μL）1μL,總體積20μL.
22℃連接2h.其中載體DNA與插入片段DNA的摩爾比為1∶（3~10）。取各連接產物5μL,轉化DH5α感受態細胞，然后鋪于LB（100μg/mL氨芐青霉素）平板上，待菌液干后翻板，37℃過夜，次日挑單菌落接種至LB液體培養基中過夜培養，擴增后按質粒小量提取試劑盒說明書提取重組質粒，分別按附表中各片段的限制性內切酶雙酶切各重組質粒篩選出陽性克隆。將陽性克隆菌各取300μL送至公司測序，測序均用pGEX通用引物。測序后將測得的序列與VIGILINcDNA全長序列用DNAman軟件比對。將鑒定好的重組質粒轉化到E.coli BL21大腸桿菌中鑒定：經酶切VIGILIN6個PCR產物及pGEX 5X3載體、連接相應的PCR產物及載體、轉化連接產物到大腸桿菌中后，各隨機挑取單個菌落進行擴增培養，然后提取質粒進行雙酶切后，用10g/L瓊脂糖凝膠電泳。
1.5 GST融合蛋白表達條件的優化（以GST-VIIGLIN N為例）以不同條件分別對GST-VIGILIN N融合蛋白進行誘導表達后，用SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的表達情況。
GST-VIGILIN N融合蛋白按培養溫度（16℃、25℃）,IPTG濃度（0.1、0.5、1.0mmol/L），誘導時間（3h、6h）的不同條件分別進行誘導表達。誘導3h、6h后各分別取出3mL培養物，10 000r/min,離心1min后棄上清，沉淀在-20℃冰箱中反復凍融2次后分別向沉淀中加入300μL細菌裂解液，冰上以150W,超聲4s、停12s的條件超聲10次后，4℃、12 000r/min離心10min.分離上清和沉淀，向沉淀中加入300μL 1×SDS上樣緩沖液，上清各取80μL加入20μL 5×SDS上樣緩沖液混勻，100℃煮5min,各取20μL用100g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，確定最適表達條件。
GST-VIGILIN全長融合蛋白按培養溫度（16℃、25℃）,IPTG濃度（0.1、0.5、1.0mmol/L），誘導時間（3h,6h,12h）誘導，其余方法同前，進行優化[11].
1.6 GST-VIGILIN全長及分段重組克隆融合蛋白表達按上述優化條件誘導表達GST-VIGILIN融合蛋白，誘導后行SDS-PAGE電泳并用抗GST的抗體做Western blot檢測融合蛋白的表達。取保種的經鑒定后構建成功的各pGEX 5X3-VIGILIN重組菌劃板，次日挑單克隆于10mL含氨芐青霉素的LB培養基中，37℃振搖過夜，取100μL菌液加入10mL含氨芐青霉素的LB培養基中，37℃、220r/min,快搖2h,至對數期（吸光度600約為0.6）.
VIGILIN分段加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L,25℃，150r/min誘導表達3h[11].VIGILIN全長加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L,16℃，150r/min誘導表達12h.取各段誘導后菌液1mL,4℃，10 000r/min離心1min棄上清，收集菌體，各加入100μL 1×SDS上樣緩沖液，沸水煮10min后瞬時離心，上清用于SDS-PAGE電泳及Western blot檢測融合蛋白的表達。
2結果
2.1 VIGILIN各片段的PCR擴增以pDsred2-N1/VIGILIN重組質粒為模板擴增VIGILINcDNA1的理論大小分別為：
N端，455bp;KH1-7,1 480bp;KH8-12,1 231bp;KH13-14,412bp;C端，242bp.
如圖1所示，各片段經電泳后呈現為清晰的單一條帶，大小與理論值大致一致。
2.2 pGEX 5X3-VIGILIN各段重組質粒的鑒定各酶切后的重組質粒分別可見約5 000bp的質粒，3 800bp左右的VIGILIN全長、450bp左右的N端、1 500bp左右的KH1-7、1 200bp左右的KH8-12、400bp左右的KH13-14、250bp左右的C端。見圖2.大小與理論值大致一致，測序結果比對后證實與目的片段完全一致。
2.3 GST-VIGILIN融合蛋白表達條件的優化如圖3所示：
GST-VIGILIN N分段融合蛋白在IPTG濃度為0.1mmol/L,溫度為25℃,誘導時間為3h和IPTG濃度為0.1mmol/L,溫度為16℃,誘導時間為6h時分布在裂解液上清較多，兩者上清中蛋白量相差不大，為了節約時間，最終選擇以IPTG濃度為0.1mmol/L,溫度為25℃,誘導時間為3h作為分段融合蛋白的表達條件。
GST-VIGILIN全長融合蛋白在IPTG濃度為0.1mmol/L,溫度為16℃,誘導時間為12h時分布在裂解液上清較多（結果未顯示），由此確定GST-VIGILIN分段融合蛋白在IPTG終濃度為0.1mmol/L,溫度為25℃誘導3h,GST-VIGILIN全長融合蛋白在IPTG終濃度為0.1mmol/L,溫度為16℃誘導12h為較理想的蛋白質誘導表達條件。在此條件下進行GST-VIGILIN融合蛋白表達。
2.4 VIGILIN全長cDNA及其分段片段的GST融合蛋白誘導表達
SDS-PAGE電泳結果見圖4A,可見GST-VIGILIN各段融合的蛋白均有表達，GST-VIGILIN全長相對分子質量約為170×103,GST-VIGILIN N端相對分子質量約為40×103,GST-VIGILIN KH1-7相對分子質量約70×103,GST-VIGILIN KH8-12相對分子質量約為60×103,KH13-14相對分子質量約為40×103,C端相對分子質量約為30×103.所有片段大小與估計值大致相符。
Western blot結果見圖4B,GST-VIGILINKH1-7在略小于70×103處有條帶，GST-VIGILINKH8-12在略小于主帶的地方同樣有一條帶。
3討論
研究顯示VIGILIN蛋白參與了不同基因、mRNA、tRNA、蛋白多層次的調控。目前已發現的有VIGILIN與脂蛋白脂肪酶（LPL）復合體結合參與脂蛋白脂肪酶在血管內皮細胞的轉運，調控血漿甘油三酯的代謝[13];VIGILIN與信號肽肽酶signalpeptide peptidase（SPP）形成復合體參與膜蛋白的翻譯和錯誤折疊的消除[14];VIGILIN與mRNA結合維持mRNA的穩定性，與tRNA及翻譯延長因子結合保證翻譯的效率[15];VIGILIN與組蛋白甲基轉移酶SUV39H1結合，維持異染色質的穩定性[16];我室前期研究發現VIGILIN與轉錄因子CTCF相互作用參與CTCF依賴的IGF2/H19印記基因的調控[7];CTCF介導VIGILIN在衛星序列2結合的減少從而引起HP1a的結合減少等[17].但VIGILIN與這些蛋白質、RNA以及基因相互作用的機制尚不完全清楚。
為了進一步研究VIGILIN蛋白與其他因子相互作用的機制，本研究根據VIGILIN蛋白不同的結構域首次成功分段克隆了GST-VIGILIN融合蛋白原核表達載體，并且利用原核表達系統首次成功誘導出GST-VIGILIN融合蛋白。值得注意的是，在Western blot結果中融合蛋白GST-VIGILINKH1-7及GST-VIGILIN KH8-12分別在略小于主帶的地方有一條帶，說明融合蛋白GST-VIGILINKH1-7及GST-VIGILIN KH8-12在原核表達系統中可翻譯出兩種分子大小不同的蛋白質，據報道VIGILIN基因可以翻譯出相對分子質量約140×103、110×103、90×103、70×103等多種大小不等的蛋白質，在真核細胞中行使不同的功能。但在單純的SDS-PAGE電泳中并未觀察到以上現象，這可能與Western blot在檢測蛋白質表達方面靈敏度遠遠高于單純的SDS-PAGE電泳有關。這兩種融合蛋白的兩種不同蛋白質的區別有待進一步確認。
本研究采用的原核表達系統大大增加了蛋白表達量，但由于真核生物基因組的復雜性，原核表達系統相比之下缺乏轉錄后的剪接和加工系統；缺乏翻譯后的加工修飾如糖基化、磷酸化、甲基化從而影響蛋白質的功能；在原核系統中表達的真核蛋白缺乏穩定性，容易被細菌蛋白酶污染、常常形成包涵體等。此外，原核表達系統中并無與該蛋白相互作用的其他因子，原核表達系統并不能完全模擬真核表達系統，所以在原核表達系統中通常只能模擬真核細胞蛋白質的直接簡單的相互作用。但由于真核細胞中蛋白表達產量低，真核表達系統價格昂貴，目前原核表達系統運用仍然較廣泛。
綜上，本研究成功構建了VIGILIN分段原核表達載體，成功誘導出GST-VIGILIN融合蛋白并進行了鑒定，為進一步研究VIGILIN蛋白的功能打下基礎。同時本研究也存在不足之處：由于沒有針對VIGILIN分段蛋白的特異性抗體所以無法用VIGILIN抗體檢測VIGILIN分段蛋白。
