N-?；呓z氨酸內酯 （N-acylhomoserine lactone,AHL） 是革蘭氏陰性細菌群體感應系統中最關鍵的一類信號分子，可調控相關致病基因的表達，引起動植物病害[1].當病原菌釋放到環境中的AHL濃度達到一定閾值時能夠誘導致病菌毒力基因的表達，造成動植物病害[2 - 5].蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis,Bt） 中的aii A基因 （auto inducer inactivation A,aii A） 編碼的Aii A蛋白是一種N-?；呓z氨酸內酯酶 （AHLase） ,能水解AHL信號分子的內酯鍵破壞其構象，減少AHL的積累，抑制致病菌毒力基因的表達，從而實現對相關植物病害的防治，有望成為農業生產上一種生物農藥[6 - 7].利用基因工程菌高表達AHL內酯酶將成為防治革蘭氏陰性病原菌的重要手段[8 - 10].

當前研究人員已在多個不同的表達系統中實現了Aii A蛋白的表達，如大腸桿菌 （Escherichia co-li）[11 - 12]、枯草芽胞桿菌 （Bacillus subtilis）[13]以及畢赤酵母 （Pichia pastoris） 等表達系統[9,14].但前期研究發現，在大腸桿菌表達系統中Aii A蛋白大多以包涵體形式存在，需要進行繁瑣的變復性才可獲得具有較高生物活性的Aii A蛋白[15]; 枯草芽胞桿菌表達的Aii A蛋白易被宿主自身分泌的蛋白酶降解； 畢赤酵母表達系統能夠實現蛋白的分泌表達，具有高的遺傳穩定性、較快的繁殖速度、表達產物易于大規模分離純化等特點，彌補了大腸桿菌和枯草芽胞桿菌表達系統的缺點，使其在原核基因和真核基因的異源表達中具有很大優勢[16].但是前期研究也發現畢赤酵母表達系統存在蛋白表達水平不如枯草芽胞桿菌或者大腸桿菌等原核宿主的缺點[14].本研究基于前期對aii A基因的密碼子偏好性分析[17],根據畢赤酵母基因組密碼子用法及可能影響畢赤酵母轉錄效率的因素對aii A基因進行全序列同義設計[18 - 20],利用優化后的aii A基因 （Oaii A） 構建多拷貝重組畢赤酵母，以期提高畢赤酵母表達Aii A蛋白的水平。

1材料和方法

1. 1材料

1. 1. 1質粒與菌株

載體p PICZαB和GS115購自Invitrogen公司；E. coli DH5α感受態細胞由本實驗室保存； 胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌 （Erwinia carotovora） 由福建省農業科學院邱思鑫研究員饋贈。

1. 1. 2主要試劑

T4 DNA連接酶、所有限制性內切酶均購自Promega公司； 堿性磷酸酶CIAP（alkaline phospha-tase,calf intestinal）、DNA Maker均購自Ta KaRa公司；Zeocin抗生素購自上海英駿生物技術有限公司；San Prep柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。兔源抗組氨酸標簽抗體 （ 一抗A,識別融合蛋白組氨酸標簽部分）、聚偏二氟乙烯 （polyvinylidene fluoride,PVDF） 膜、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠Ig G（H + L） 購自北京鼎國生物技術有限公司； 鼠源抗Aii A特異性抗體（ 一抗B,識別融合蛋白Aii A部分） 由本實驗室制備。

1. 1. 3培養基

①LLB（low salt luria-bertani） 培養基 （1 L） : 酵母提取物5. 0 g,胰蛋白胨10. 0 g,Na Cl 5. 0 g,調p H至7. 5,高壓滅菌。配制固體培養基時，在滅菌前加入體積分數為2%的瓊脂。 ②酵母浸出粉胨葡萄糖培養基 （yeast extract peptone dextrose medium,YPD） （1 L） : 將10. 0 g酵母提取物，20. 0 g蛋白胨，20. 0 g無水葡萄糖溶解于1 L水中，115 °C滅菌15 min.配制固體YPD培養基時，在滅菌前加入體積分數2%的瓊脂。 ③其余培養基： 緩沖復合甲醇培養基 （buffered methanol-complex medium,BMMY） ,緩沖復合甘油培養基 （buffered glycerol-complex medium,BMGY） ,最小甲醇培養基 （mini-mal methanol,MM） , 最小葡萄糖培養基 （minimal dextrose medium,MD） 等均參照Invitrogen的Pichia Expression Kit說明書進行配制。

1. 2方法

1. 2. 1基于畢赤酵母偏好密碼子的aii A基因密碼子優化設計

影響基因在宿主中表達效率的主要因素包括GC含量、tRNA豐度、密碼子用法等[20].密碼子優化遵循如下規則： （1） 對稀有密碼子較為集中的區域進行整體優化，以達到最佳優化效果； （2） 調整富含AT和GC的區域，使序列的GC含量適中； （3） 宿主中的tRNA豐度在很大程度上影響著基因的表達效率，為了防止宿主中可能出現的tRNA衰竭，從而導致轉錄提前終止的現象，不應在設計基因時全部采用宿主的最優密碼子，而是適當使用次優密碼子，使密碼子和同工tRNA濃度趨于平衡；（4） 為了防止因為復雜序列引起的轉錄提前終止或者轉錄效率低下，應當避免優化后的基因出現如“AATAA”、“ATTTA”、“AATTAA”等序列。利用DNA2. 0,參考畢赤酵母密碼子偏好性數據表 （ht-tp:/ / www. kazusa. or. jp / codon / cgi-bin / showcodon. cgi?species = 4922&aa = 1&style = N） ,對Aii A蛋白編碼序列進行重新設計，根據上述基因優化設計原則進行手動調整，增加后續實驗所需的酶切位點（EcoR Ⅰ與Not Ⅰ） ,送上海鉑尚生物技術有限公司進行全基因合成，獲得含有優化后的aii A基因亞克隆質粒p UC57-Oaii A.

1. 2. 2 Oaii A多拷貝表達載體的構建及驗證

利用堿裂解法大量提取質粒p UC57-Oaii A和畢赤酵母表達質粒p PICZαB,將提取的p UC57-Oaii A和p PICZαB分別用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ進行雙酶切，分別獲取含有相同粘性末端的Oaii A基因和p PICZαB表達載體。利用T4 DNA連接酶將以上兩個片段連接后導入E. coli DH5α感受態細胞中，將其均勻涂布于含有Zeocin抗性的 （25 μg·m L- 1） 的固體LLB平板上，于37 °C恒溫培養箱中倒置培養12 ~ 16 h.從上述轉化后的含Zeocin（25 μg·m L- 1） 的平板上挑取單菌落接種于含Zeocin抗性的（25 μg·m L- 1） 的液體LLB培養基中，37 °C,230 r·min- 1過夜培養。利用堿裂解法提取質粒，以此為模板，進行質粒PCR驗證。 PCR反應體系為15 μL:10 × buffer 1. 3 μL,Mg Cl21. 4 μL,d NTP0. 5 μL,引物F1（10 μmol · L- 1） 和引物F2（10 μmol · L- 1） 各0. 3 μL,DNA模板1. 0 μL,r Taq DNA聚合酶 （5 U·μL- 1）0. 3 μL,dd H2O 9. 9 μL. PCR反應條件：94 ° C 3 min,94 ° C 30 s,55 °C 30 s,72 °C 80 s,30個循環，72 °C延伸10 min.經瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，進行EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切驗證目的基因連接在載體上方向的正確性，并將構建的含單拷貝Oaii A基因的載體命名p PICZαB-Oaii A.以p PICZαB-Oaii A為基礎，利用Bgl Ⅱ和Bam H Ⅰ這對同尾酶構建含二拷貝和三拷貝Oaii A基因的表達載體，分別命名為p PICZαB-2Oaii A和p PICZαB-3Oaii A.同時通過Bgl Ⅱ和Bam H Ⅰ雙酶切驗證各表達盒連接的方向。

1. 2. 3重組轉化子GS115-p PICZαB-x Oaii A 的表型鑒定

通過分析p PICZαB載體及Oaii A基因的酶切位點，利用Sac I對單拷貝表達載體p PICZαB-Oaii A進行酶切線性化后同二拷貝表達載體p PICZαB-2Oaii A和三拷貝表達載體p PICZαB-3Oaii A通過電轉化方式分別整合至畢赤酵母GS115基因組中，構建出多拷貝工程菌GS115-p PICZαB-x Oaii A（x = 1,2,3）。對MD篩選平板上長出的菌落用PCR進一步驗證目的基因已成功整合到酵母基因組。 PCR驗證后的陽性菌株分別點種于MM和MD平板上，置于28 °C下培養2 ~ 3 d,觀察兩種平板上菌落的生長狀況，若菌落在MM、MD平板上生長狀況幾乎一致，則該單克隆為甲醇快速利用型轉化子 （Mut+） ;若單菌落在MD平板上明顯大于MM平板，則該單克隆為甲醇利用慢型轉化子 （Muts）。

1. 2. 4 Oaii A多拷貝工程菌GS115-p PICZαB-x Oaii A 的誘導表達

挑取上述驗證正確的重組轉化子GS115-p PICZαB-x Oaii A接種于5 m L YPD培養基 （ 含100 μg·m L- 1Zeocin） 中，28 °C,230 r·min- 1過夜活化； 取活化培養液500 μL接種于裝有50 m L BMGY培養基的250 m L錐形瓶中，28 °C,230 r·min- 1培養至A600為2. 0 ~ 6. 0; 將上述菌液裝于50 m L離心管中，8 000 r·min- 1離心5 min收集菌體； 用適量滅菌dd H2O重懸菌體，8 000 r·min- 1離心5 min收集菌體，重復兩次； 取適量菌體重懸于裝有50 m L BMMY培養基的250 m L錐形瓶中，使瓶中培養液A600約為1. 0,28 °C,230 r·min- 1進行誘導。每隔24 h往培養基中添加甲醇，使其體積分數為1. 0%,誘導72 h后，將培養液裝入50 m L離心管中，8 000 r·min- 1離心20 min收集發酵上清液。

1. 2. 5重組Aii A蛋白的檢測

利用鎳柱親和層析純化將GS115-p PICZαB、GS115-p PICZαB-aii A和GS115-p PICZαB-x Oaii A發酵液進行純化濃縮后，對純化產物進行SDS-PAGE和Western Blot鑒定。

1. 2. 6 ELISA比較畢赤酵母工程菌Aii A表達量

將重組畢赤酵母GS115-p PICZαB-aii A和GS115-p PICZαB-x Oaii A以1. 2. 4方法誘導后，利用本實驗室前期建立的雙抗體夾心ELISA的方法對其表達產物進行定量測定，具體操作參見曾世涌等的方法[21].制作Aii A蛋白標準曲線時，將Aii A蛋白標準品稀釋至35. 5 μg ·m L- 1后逐步以2倍稀釋至1. 11 μg·m L- 1,測定各稀釋樣品D410 nm值，實驗重復3次。以Aii A蛋白濃度的對數lg際上c為X軸，以測定的D410 nm為Y軸作圖。

1. 2. 7重組Aii A蛋白活性檢測

將GS115-p PICZαB-x Oaii A和GS115-p PICZαB發酵液進行鎳柱親和層析純化后，分別取適量純化產物與胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌培養物混勻后均勻涂抹于無菌處理過的馬鈴薯 （Solanum tuberosum） 的創面上，28 °C溫浴16 h后觀察。

2結果和分析

2. 1 aii A基因密碼子優化設計及全序列合成