雞肺表面活性蛋白A（chicken pulmonarysur-factant protein A,cSP-A）是Ⅱ型肺泡上皮細胞分泌的一種親水性糖蛋白，屬于C型凝集素家族中的一種[1].C型凝集素的共同特征在于：氨基（N）末端含有膠原樣結構域（collagen-like region,CLR）、羧基（C）端含有碳水化合物識別結構域，可與病原體和過敏原 結 合[2].cSP-A基 因 位 于 雞6號 染 色 體上，編碼區全長669bp,含222個氨基酸殘基（aa），分為5個結構域：N端區、CLR、未知區、莖區（neckdomain）和凝集素糖識別區（carbohydrate recogni-tion domain,CRD）[3].近年來，對SP-A蛋 白的免疫學功能的研究越來越深入，哺乳動物源SP-A已被證實可結合多種病原體，增強肺泡巨噬細胞的趨化作用和吞噬功能，誘導免疫細胞增殖，并刺激促炎細胞因子的產生[4].
雖然不同動物源的SP-A在功能上高度相似，但通過氨基酸序列比對卻發現：cSP-A與哺乳動物源SP-A的同源性僅有40%左右[5],cSP-A在雞體內的組織分布和臨床作用是否與哺乳動物源的SP-A一致尚不得而知[1],而且，從雞肺泡灌洗液獲取天然cSP-A蛋白的步驟較為繁瑣，費用昂貴，阻礙了cSP-A的臨床研究和應用。
本實驗室的前期工作已經對cSP-A的N末端和CRD分別進行了原核表達和多克隆抗體制備[6],但沒有涉及cSP-A全長基因的研究。本研究將 選擇pCold-TF載體進行cSP-A全基因的載體構建，以期在大腸桿菌中實現高效可溶性表達，并對純化產物進行生物學活性檢測，為進一步研究cSP-A的功能和臨床作用奠定基礎。
1材料與方法
1.1實驗動物與試劑
60日齡健康三黃雞1只購自安徽省某 雞 場。pMD19-T Simple、pCold-TF原核表 達 載 體 均 購 自寶生物工程（大連）有限公司。大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感 受 態、TRIzol試 劑 均 購 自 美 國In-vitrogen公司。反轉錄試劑盒購自普洛麥格生物技術有限 公 司。Phanta Max Super-FidelityDNA聚合酶購自南京諾唯贊生物公司。T4DNA連接酶、限制性內切酶NdeⅠ和SalⅠ均購自英國NEB公司。DL2000DNA ladder、凝膠回收試劑盒均購 自德國Qiagen公司。質粒小量提取純化試劑盒購自美國Axygen公司。His·Tag融合蛋白純化試劑盒購自德國Merck公司。10~250ku預染小分子質量蛋白質Marker購 自 美 國 熱 電 公 司。HRP標記的山羊抗小鼠IgG購自美國Sigma公司。ECL顯色發光試劑盒購自美國Piece公司。cSP-A的凝集素糖識別區多克隆抗體由本實驗室制備[6].純化的天然cSP-A蛋白由本實驗室制備[6-7].
1.2 RT-PCR
取健康雞肺組織100mg,加入TRIzol試劑提取組織mRNA,-80 ℃保存備用。參照GenBank中cSP-A登錄的全長序列（AF411083）設計了1對引物，上游 引 物：CCCAAGCAACCATGTTGTCT-TATT,下 游 引 物：CTAATATTCACAGACTGT-GAGGCGG.利用Oligo d（T）18引 物 對 雞 肺 組 織mRNA進 行 反 轉 錄 并 獲 得 其cDNA,然 后 進 行PCR,擴增程序：95℃ 5min;94℃ 30s,60℃ 50s,72℃ 1min,共30個循環；72℃ 10min;維持在10℃。PCR產 物 進 行 電 泳 鑒 定，回 收 目 的 條 帶，與pMD19-T Simple載 體 連 接，連 接 產 物 轉 化DH5α感受態細胞，涂布含100μg/mL氨芐青霉素（Amp）的LB平板，過夜培養，挑取陽性菌落進行PCR鑒定，并送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。
1.3 cSP-A成熟肽基因的PCR擴增
在獲得cSP-A全長序列的基礎之上，設計1對引物 用 于 擴 增cSP-A成 熟 肽 全 長，上 游 引 物 為cSPA-55F:ATTCATATGCCATGCACAGAAC（下劃線處為NdeⅠ酶切位點），下游引物為cSPA-R:ATAGTCGACCTAATATTCACAG（下 劃 線 處 為SalⅠ酶切位點）。PCR反應條件：94 ℃ 2min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min,30個循環；72℃ 10min;10 ℃維持。PCR產物進行電泳 鑒定，回收目的條帶，-20℃儲存備用。
1.4重組表達載體的構建
利用限制性內切酶NdeⅠ+SalⅠ分別對目的基因的PCR產物和pCold-TF表達載體質粒DNA進行雙酶切，將純化回收的PCR產物與相應酶切的表達載體連接，轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞。PCR篩選陽性克隆，提取質粒DNA,送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。
1.5重組蛋白的誘導表達、純化
將pCold-TF與pCold-cSPA均 轉 化 到BL21（DE3）感受態細胞中，37℃培養過夜。取少量利用不同濃度的IPTG進行誘導表達，16℃誘導24h后收集菌液，超聲波裂解，5000r/min離心10min,分別收取裂解上清和包涵體沉淀。利用His·Tag融合蛋白純化試劑盒純化。分別取上述少量蛋白質樣品，加入 等體積2×上樣緩 沖液，95 ℃加 熱處 理5min,同時將pCold-TF空載體菌誘導產物作為陰性對照。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析融合蛋白的表達情況。
1.6免疫印跡
分別取0.1、0.5和1μg的cSP-A純化產物，加入等量的2×上樣緩沖液，95℃加熱處理5min后，經SDS-PAGE分離，利用垂直轉印儀，將膠上蛋白質轉移至硝酸纖 維素膜（NC）上，經考馬斯 亮藍染色，將NC膜轉移到50g/L脫脂奶粉溶液中4℃封閉過夜。棄封閉液，TBST洗 滌后，加1∶1 000稀釋的cSPA-CRD小鼠多克隆抗體，室溫下反應2h,TBST洗滌3~5次，二抗為1∶5 000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG,室溫作用1h,TBST洗滌3~5次，用化學發光試劑盒（ECL）進行顯色，在天能發光成像系統中成像分析。
1.7雞肺灌洗液的制備及天然SP-A蛋白的制備與純化
選取1.5kg左右的健康三黃雞，按150mg/kg體質量注射戊巴比妥進行麻醉，對雞頸部皮膚進行剝離，用手術刀做1cm縱切口，將連有醫用三通閥的灌洗裝置插入雞氣管內，一次性注入15mL滅菌PBS溶液，反復灌洗，收集洗液，經1 000r/min離心10min,收集上清即為肺部灌洗液。采用Maltose-agarose親和層析法[7]提取并純化雞肺灌洗液中的SP-A蛋白。
1.8抑菌活性檢測
采用單層瓊脂平板擴散法進行檢測，以純化的天然cSP-A蛋白作為對照。分別取巴氏桿菌、大腸桿 菌（CMCC44102）、甲 型 副 傷 寒 沙 門 菌（ATCC9150）、金 黃 色 葡 萄 球 菌（ATCC25923）、糞腸球菌（CMCC29212）于LB培養基平板劃線，37℃過夜培養?；罨蟮闹甘揪?∶100滴加到40℃左右滅活的LB培養液中，振蕩混勻，倒入滅菌的平板中，冷卻凝固后，用內徑7mm的打孔器分別在各指示菌平板上均勻打孔，依次加入1μg純化的天然cSP-A蛋白、1μgpCold-cSPA原核表達純化蛋白、1μgpCold-cSPA誘導表達產物、50μL無菌水（陰性對照）、50μL卡那霉素（100μg/mL）（陽性對照）。
2結果
