基因工程是以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。本文提供幾篇有關基因工程的論文優秀范文，供大家學習。

有關基因工程的論文一：

《重組人纖維蛋白原基因在畢赤酵母中的高效表達》

［摘要］目的構建含有人纖維蛋白原基因的畢赤酵母表達系統，實現胞外高效分泌表達。方法全基因合成人纖維蛋白原3個基因FGA、FGB、FGG，構建表達載體pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1，線性化后電轉化導入畢赤酵母菌株SMD1168H，抗性篩選獲得陽性克隆。發酵液經SDS-PAGE確定蛋白表達部位，ELISA檢測目的蛋白表達量。表達產物超濾濃縮后利用AKTA蛋白純化系統進行分離純化，Westernblot檢測蛋白表達情況并對純化產物進行生物學活性測定。結果基因工程菌株搖瓶培養上清液表達量約15mg/L，生物學活性分析重組蛋白具有凝集活性。結論成功獲得了高效分泌表達重組人纖維蛋白原的畢赤酵母菌株，且分離純化的蛋白具有生物凝集活性。

［關鍵詞］重組人纖維蛋白原;畢赤酵母;分泌表達;分離純化

目前世界衛生組織確認的凝血因子共13個，大多由肝臟產生，正常情況下，所有凝血因子都處于無活性狀態，以無活性酶原形式存在，當某一凝血因子被激活后，可使許多凝血因子按一定的次序先后被激活，逐級放大，直到纖維蛋白形成，血液發生凝固。纖維蛋白原\\(fibrinogen，Fg\\)，即凝血因子Ι，是參與血液凝固的重要凝血因子，血漿中含量高達2000～4000mg/L［1］，其分子量340kDa，由完全相同的2個亞基組成共價二聚體，每個亞基含有α\\(63.5kDa\\)、β\\(56kDa\\)、γ\\(47kDa\\)3條肽鏈［2］，分別由4號染號體\\(4q28-30\\)上的3個獨立的基因FGA、FGB、FGG編碼形成，在肝臟中由獨立的核糖體合成其前體蛋白，再經過內質網和高爾基體完成蛋白的組裝，各肽鏈彼此通過二硫鍵相互連接形成Fg單體。2個單體通過3對鏈間二硫鍵連接形成對稱性二聚體，即Fg。

纖維蛋白原參與凝血過程的機理:當血液中的凝血酶原被激活時，凝血酶作用于纖維蛋白原，切斷纖維蛋白原α鏈N末端區域和β鏈N末端區域，α鏈的解離有利于纖維蛋白網絡呈線性增長，β鏈的解離有利于纖維蛋白網絡呈側向增長，最終纖維蛋白單體以錯綜重疊狀態側向聚合締結為網絡構成的血凝塊［3］。凝血初期非共價鍵結合可溶性的血凝塊，然后在體內凝血因子ⅩⅢ\\(谷氨酰胺轉移酶，又稱纖維蛋白穩定因子\\)和Ca2+作用下，纖維蛋白單體通過ε-氨基-γ-谷氨?；B接，形成不溶性的穩定血凝塊［4］，從而發揮凝血和生理性止血功能。另外，纖維蛋白原還參與體內血小板聚集、纖溶調節、動脈硬化的發生發展、組織損傷及修復等一系列病理和生理過程［5-8］。

醫藥級纖維蛋白原提取于人體血液，生產成本高昂且難以避免血源性傳染病\\(如乙肝和艾滋病等\\)的傳播風險，影響其市場應用及推廣。隨著分子生物學發展，采用基因工程方法高效表達安全、可靠的人纖維蛋白原成為研究熱點。2011年，黃星等［9］將人纖維蛋白原基因在大腸桿菌BL21菌株中進行誘導表達，發現人纖維蛋白原3個亞基不能共表達，即纖維蛋白原的β、γ鏈能用pET系列載體獲得表達，而α鏈卻未能獲得表達。大腸桿菌等原核生物表達系統還存在目的蛋白無法正確折疊修飾等空間結構問題，影響纖維蛋白原生物活性。動物細胞表達系統中，雖然可以通過哺乳動物乳腺生物反應器獲得特異性表達具活性的纖維蛋白原，但存在投入成本高、基因打靶的位置效應導致基因整合具隨機性、重組蛋白與天然蛋白修飾加工仍存在差異等問題，難以實現規?；a［10-11］。酵母表達系統可以克服大腸桿菌和動物細胞表達系統的不足，通過高密度發酵實現工業化生產，蛋白質翻譯后的修飾加工功能更加完善，蛋白產物更接近天然蛋白質功能。本研究擬通過構建重組人纖維蛋白原酵母表達載體獲得高效分泌表達的畢赤酵母菌株，分離純化具生物活性蛋白，為進一步開發有效的藥用纖維蛋白原奠定基礎。

1、材料與方法

1.1、材料

1.1.1、質粒與菌株:質粒pGAPZαA\\(Invitrogen\\)，含有GAP啟動子和Zeocin抗性基因，作為表達載體;質粒pPIC9K，僅用于AOX1基因的PCR擴增，并將該基因連接入pGAPZαA表達載體，利用AOX1作為線性化位點進行同源重組，以上質粒均為本實驗室保藏。菌株以畢赤酵母\\(Pichiapastoris\\)SMD1168H作為表達宿主，為本實驗室保藏。

1.1.2培養基:低鹽LB培養基\\(g/L\\):蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉5，pH7.5;YPD培養基\\(g/L\\):胰蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，固體培養基含1.5%瓊脂粉。

1.1.3、試劑:限制性內切酶、T4DNA連接酶等購自NEB公司、Taq酶、DNAMarker、蛋白分子量Marker等購自Fermentas公司，抗生素Zeocin購自Invitrogen公司，質粒抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自Omega公司，超濾管購自Millipore公司，層析柱填料SephacrylTMS-100HR購自GE公司，ELISA試劑盒購自Bio-Swamp公司，鼠抗人單克隆抗體\\(α、β、γ\\)、辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠IgG均購自SantaCruz公司，DAB顯色試劑盒購自Tiangen公司。其他試劑均為市售分析純。

1.1.4、儀器:搖床\\(伊孚森生物技術中國有限公司\\)、PCR儀\\(Eppendorf\\)、離心機\\(Thermo\\)、電轉化儀\\(Biorad\\)、酶標儀\\(Tecan\\)、蛋白電泳設備\\(Biorad\\)、AKTA蛋白分離純化儀\\(AKTAExplorer\\)、生物樣品均質器\\(Bertin\\)。

1.2、方法

1.2.1、pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1重組質粒的構建

NCBI數據庫檢索人纖維蛋白原FGA、FGB、FGG基因序列\\(GeneID分別為2243、2244、2266\\)，根據宿主菌株畢赤酵母密碼子偏好性進行序列優化，并設計合適的酶切位點，對含GAP啟動子和AOX1TT終止子表達框的全基因序列合成，重組質粒載體如圖1所示，具體步驟如下:

圖1 重組人纖維蛋白原酵母表達載體的構建圖

①限制性內切酶NheⅠ、BamHⅠ分別雙酶切FGB基因和pGAPZαA質粒，經純化連接轉化E.coliTop10感受態細胞，于25μg/mLZeocin低鹽LB固體培養基篩選陽性轉化子，獲得pGAPZαA-FGB重組質粒。

②限制性內切酶BglⅡ分別單酶切FGG基因和pGAPZαA-FGB質粒，載體脫磷酸化并純化，連接轉化E.coliTop10感受態細胞，抗性篩選獲得pGAPZαA-FGB-FGG重組質粒。

③限制性內切酶NdeⅠ分別單酶切FGA基因和pGAPZαA-FGB-FGG質粒，載體脫磷酸化并純化，連接轉化E.coliTop10感受態細胞，抗性篩選獲得pGAPZαA-FGB-FGG-FGA重組質粒。

④以pPIC9K質粒為模板PCR擴增AOX1基因，PstⅠ單酶切AOX1基因和pGAPZαA-FGB-FGG-FGA重組質粒，載體脫磷酸化并純化，連接轉化E.coliTop10感受態細胞，抗性篩選獲得pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1重組質粒。

每一步重組質粒構建均經生物公司測序正確后，再進行下一個目的片段的連接。

1.2.2、畢赤酵母的電轉化及PCR擴增驗證:PmeⅠ單酶切線性化重組質粒pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1，膠回收純化，按《畢赤酵母表達操作手冊》［12］方法電轉化導入畢赤酵母SMD1168H感受態細胞，電轉化條件:1.5kV，200Ω，25μF。電轉化后酵母細胞涂布于含1μg/mLZeocin抗性平板，28℃培養2d，篩選陽性轉化子，以破壁重組子為模板，PCR擴增檢測重組載體的FGA、FGB、FGG基因驗證。

1.2.3、重組人纖維蛋白原的表達:挑取單克隆于YPD培養基\\(含1μg/mLZeocin\\)，28℃，220r/min培養60h。采用生物樣品均質器對發酵液及菌體破碎，均質速度6500r/min，3個循環，每個循環運行時間為30s，循環間隔30s。參考《精編分子生物學實驗指南》［13］對全細胞破碎液、菌體沉淀破碎液及發酵上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，確定目的蛋白的表達部位，ELISA試劑盒檢測確定目的蛋白的表達量。

1.2.4、重組人纖維蛋白原的Westernblot檢測:發酵上清液經30kDa超濾管濃縮，AKTA純化系統分離，收集蛋白吸收峰值處洗脫液進行二次超濾濃縮獲得純化蛋白。純化條件:分子篩層析柱ColumnXK16，凝膠填料為SephacrylTMS-100HR，流速0.5mL/min，上樣量5mL。純化蛋白分別以小鼠單克隆一抗\\(α、β、γ\\)\\(稀釋比例1∶1000\\)，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗\\(稀釋比例1∶10000\\)進行Westernblot，抗體孵育結束后洗膜3次，DAB顯色試劑盒顯色，具體操作方法參考《精編分子生物學實驗指南》［13］。

1.2.5、重組人纖維蛋白原的生物活性測定:AKTA純化蛋白洗脫液4℃透析過夜\\(20mMHEPES，pH7.4，150mMNaCl，5mMεACA，1mMCaCl2\\)，添加外源0.1U/mL凝血酶、0.02U/mL凝血因子ⅩⅢ，37℃條件下參照2015年版中國藥典方法［14］檢測纖維蛋白原凝集活性。