棉花黃萎病是一種真菌性病害，廣泛分布于世界各產棉國，造成嚴重的經濟損失，其病原菌主要為半知菌亞門輪枝孢屬大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）。研究大麗輪枝菌的遺傳轉化對于研究大麗輪枝菌與棉花的互作關系，進而防治棉花大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病具有重要意義。

農桿菌介導的遺傳轉化法（ATMT）是現在常用于真菌遺傳轉化的方法，在很多的真菌上都取得了成功的應用。由于農桿菌轉化體系是一個天然的轉化系統，其具有成功率高，遺傳穩定性好的優點，可使外源基因攜帶不同的啟動子在不同組織里特異表達，且其Ti質粒載體可容納大片段的異源基因，所以成為目前最為常用的真菌轉化方法，用于插入突變和基因標記等方面。E. D. Mullins等人成功的將改造好pBHt1載體通過ATMT法轉入到黃瓜尖鐮孢菌Fusarium oxysporum中[1],陳強等人利用條件優化該方法將GUS-GFP轉入到黃萎病菌中并成功獲得了轉報告基因（GUS-GFP）的黃萎病菌單胞[2].

另外利用該方法在Cochliobolus heterostrophus 玉米葉枯病菌和 A.nidulans構巢曲霉中高水平的表達了sGFP熒光蛋白報告基因[3],同時在 Pyrenophora tritici-repentis 小麥黃斑葉枯病菌也表達了EYFP,ECFP和 mRFP1這三個熒光蛋白[4].這些報道表明，該方法用于真菌的轉化及外源基因的表達是一個十分有效的方法。

目前應用于大麗輪枝菌的遺傳轉化大多數是采用根瘤農桿菌介導的遺傳轉化方法，并已經得到了廣泛的應用。為了使ATMT法更好地應用于大麗輪枝菌的轉化，很多研究將ATMT法進行了相應的優化，研究表明在篩選轉化子的過程中，潮霉素濃度為 50 μg/mL ,用于對農桿菌抑制的頭孢噻肟鈉的最佳濃度為500 μg/mL .研究還發現相比于農桿菌菌株SK1044和EHA105,農桿菌菌株AGL-1和LBA4404更適用于大麗輪枝菌的轉化[5].另外，利用ATMT轉化方法，將pCTHyg上的T-DNA轉入大麗輪枝菌Vd991的基因組中，得到豐富的插入突變體，并對其中30株突變體進行了表型特征和T-DNA插入位點側翼序列分析[6].KatherineF等人將大麗輪枝菌枯萎病菌中的胰蛋白酶基因VTP1,構建缺失突變體通過ATMT法轉化到大麗輪枝菌中，從而在分子水平上分析研究黃萎病病原菌的影響[7].另外最近有研究結果表明，ATMT方法可以有效地被用來鑒別與棉花黃萎病菌中致病性和其他功能相關的基因[8].

至目前，用于在真菌中轉錄表達基因的啟動子主要是trpC、gpdA啟動子[9].J. WANG等人將兩個過氧化物酶體的信號蛋白PTS1 and PTS2與GFP基因融合，利用來源于稻瘟病菌的MPG1基因作為啟動子在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中轉錄表達融合基因來研究了過氧化物酶體的生物學作用[10].這表明MPG1基因作為啟動子在稻瘟菌遺傳轉化中轉錄表達GFP獲得成功。本文通過ATMT法將載體pHMG轉入大麗輪枝菌中來探討MPG1基因作為啟動子能否在大麗輪枝菌中驅動GFP基因轉錄表達。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種和培養基

pHMG載體為浙江省農科院王教喻副研究員贈送，如圖1所示，采用trpC啟動子驅動潮霉素抗性基因轉錄表達，采用了一個新的啟動子MPG1基因轉錄表達GFP.大腸桿菌感受態DH5α購自Takara公司，農桿菌AGL-1感受態為本課題組自制，棉花大麗輪枝菌T-9菌株來源于西北農林科技大學楊家榮教授贈送LB培養基用于大腸桿菌培養和農桿菌（10 g/L胰蛋白胨；5 g/L酵母提取物；10 g/L NaCl;固體培養基添加1.5%瓊脂粉）；PDA培養基（200 g/L土豆，20 g/L蔗糖；固體培養基添加1.5%的瓊脂粉）用于大麗輪枝菌的培養。

1.2 酶與試劑

Taq酶及PCR配套試劑（Takara 公司），引物合成（上海Invitrogen 公司），卡那霉素（Kana）和頭孢霉素（Cef）購自于上海生工生物有限公司，潮霉素（Hyg）購自于羅氏公司，GFP一抗和二抗購于浙江杭州華安生物技術有限公司。

1.3 農桿菌介導的遺傳轉化

ATMT轉化大麗輪枝菌的步驟參考陳強等[2]、陳天子等[5]、Mullins等[1]的方案進行農桿菌介導的大麗輪枝菌轉化。

具體步驟如下：將棉花大麗輪枝菌菌株T9接種到PDA固體培養基上，25℃，培養7~10 d.活化農桿菌：從LB平板（含50 μg/mL Kana、30 μg/mL Rif）上挑取農桿菌單菌落接種于5mL LB液體培養基（含50 μg/mL Kana、30 μg/mL Rif），220 r/min,28℃過夜培養；5000 r/min離心3 min,棄去上清，用 IM 液體培養基（含 200 μMAS）稀釋至OD600=0.1~0.2,誘導培養 4~6 h 至 OD600=0.6;用 3mL IM液體培養基（含200 μMAS）輕輕反復沖洗平板上培養的大麗輪枝菌分生孢子，過濾菌絲后用血球計數板計數，稀釋至孢子濃度為 106個/mL.將500 μL已活化的農桿菌AGL-1和500 μL黃萎病孢子稀釋液充分混勻后涂布于MM平板（含200 μMAS）的濾紙上，25℃，黑暗倒置培養2d;將 MM（含 200 μMAS）平板上的濾紙轉移至PDA篩選固體培養基（含50 μg/mL Hyg和200 μg/mL Cef、400 μg/mL Mox），25℃繼續培養 5~7 d.

挑取長勢較好的真菌單菌落轉化子，至新的PDA篩選固體培養基（含50 μg/mL Hyg和200 μg/mLCef、400 μg/mLMox）上。

挑取轉化子菌絲制成樣本，置于熒光導致顯微鏡下觀察綠色熒光。

1.4 SDS-CTAB 法提大麗輪枝菌菌基因組及PCR鑒定

大麗輪枝菌培養及基因組提?。禾羧∫焉L約有7 d的轉化子，切塊培養真菌菌絲，于PDA液體培養基中培養5~7 d后，收集菌體，真空抽干后保存于-80℃備用。用SDS-CTAB法提取基因組，將-80℃下放置的材料稱取0.1 g,加入液氮研磨成粉末，加入1.5 mL的EP管中（1/3 V）；迅速加入500 uL 65℃預熱的SDS抽提液中，震蕩搖勻后放于65℃水浴鍋30~45 min.期間每隔10~15 min顛倒一次；加入 100 μL（1/5 V）65℃預熱的 5×CTAB抽提緩沖液搖勻后，再置于65℃水浴鍋中20 min;冷卻后加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），顛倒混勻成乳狀，室溫下12000 r/min離心5 min后取上清。再加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提一次，室溫下 12000 r/min 離心 5min后取上清；加入等體積的異丙醇，-20℃靜置30 min 后 4℃，12000 r/min 離心 10 min,收集沉淀；沉淀用75%乙醇洗沉淀3~5次，真空干燥5~10 min后放于-20℃備用。

為了確定插入的片段是否整合到大麗輪枝菌基因組中，PCR擴增檢測轉化子是否為大麗輪枝菌，GFP序列在基因組序列中是否存在。

1.5 酚抽提法提取真菌總蛋白及Western Blot鑒定

1.5.1 酚抽提法提取大麗輪枝菌總蛋白

稱取0.25 g存于-80℃的真菌菌絲，加入液氮研磨至粉末，每0.1 g菌體加500 μL真菌蛋白抽提液，冰浴10 min;加入等體積的Tris飽和酚，室溫下震蕩混勻后，4℃，13000 r/min離心15 min;去上清保留有機酚相層，并加入四倍體積預冷的甲醇，于-20℃至少孵育 6 h;4℃，13000 r/min 離心15 min,獲取粗蛋白沉淀；加入等體積預冷的甲醇洗滌粗蛋白沉淀，4℃，13000 r/min離心10 min;去除甲醇，將沉淀真空抽干，得蛋白粉末，溶于適量的ddH2O中，保存于-80℃，備用。

1.5.2 Western Blot鑒定

采用Western Blot檢測GFP基因是否在所提大麗輪枝菌總蛋白中是否存在。具體如下。

第一步，轉膜：取總蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，95℃恒溫金屬浴變性5 min,電泳結束后，去蛋白的濃縮膠，保留分離膠并切去其左上角以標記正面，將修建好的蛋白膠放于轉膜緩沖液中浸泡15 min,同時準備與膠同等大小的碳酸纖維素膜和濾紙，同樣切去左上角進行標記，并將它們放入轉膜緩沖液中浸泡 15 min;從下往上依次疊放濾紙三張、碳酸纖維素膜、蛋白膠和濾紙三張，盡量排出氣泡后，100 mA恒流轉膜1 h;轉膜結束后，膜用麗春紅染液染色以查看轉膜是否成功，若條帶清楚且一致說明轉膜成功，拍照并記錄結果。

第二步，雜交：將膜放入20 mL封閉液（含5%脫脂奶粉的1×TBS）中，于搖床上室溫封閉2 h;棄去封閉液，用20 mL 1×TBS于搖床室溫洗膜10 min;將膜放入10 mL與1∶5000稀釋的一抗混合的封閉液中，于搖床室溫孵育 2 h;棄去混合液，用 20 mL 1×TBST溶液于搖床室溫洗膜三次，每次10 min,再用20 mL 1×TBS于搖床室溫洗膜10 min;將膜放入10 mL 與1∶5000稀釋的二抗混合的封閉液中，于搖床室溫孵育 1 h;棄去混合液，用 20 mL 1×TBST溶液于搖床室溫洗膜三次，每次10 min,再用20 mL 1×TBS于搖床室溫洗膜10 min;準備一張保鮮膜，于保鮮膜上加入500 μL ECL Plus Reagent A和500 μL ECL Plus Reagent B,混勻。將膜正面朝下覆蓋于混合液上，排出氣泡，室溫反應5 min,盡量去除多余液體；暗室觀察熒光并壓片，壓片后顯影液洗片30 s,定影液洗片30 s,觀察結果。

2 結果

2.1 大麗輪枝菌轉化子生長情況及熒光觀察

將pHMG通過ATMT法轉入棉花大麗輪枝菌菌株T-9中，在轉移到篩選培養基上長出的轉化子如圖2,轉化率為約80個/106.將pHMG轉T-9的轉化子#1號置于熒光倒置顯微鏡下觀察菌絲及孢子，結果如圖3,觀察到該轉化子的菌絲及孢子都能發出綠色熒光，表明該pHMG載體已經成功轉入大麗輪枝菌T-9菌株中。

2.2 大麗輪枝菌轉化子的基因組DNA檢測

利用SDS-CTAB改良方法分別提取pHMG轉化子的基因組DNA,并且用大麗輪枝菌特異引物鑒定[11]轉化子菌株是否為大麗輪枝菌，避免其他真菌的污染，如圖2.3電泳結果所示，都能擴增出大麗輪枝菌特異條帶，大小為324 bp,表明轉化子是大麗輪枝菌。用eGFP片段引物對所提真菌基因組進行PCR鑒定，結果如圖4,PCR結果與目的序列大小相符合。檢測結果基本證明目的片段序列已轉入大麗輪枝菌中。

2.3 大麗輪枝菌轉化子的GFP蛋白表達鑒定

利用酚抽提法提取大麗輪枝菌轉化子菌株的總蛋白，采用Western Blot檢測陽性轉化子中插入的GFP基因是否已經表達，結果如圖6所示，樣品有唯一條帶在27KD處，對照無條帶。結果表明，GFP基因在大麗輪枝菌轉化子中成功地表達了GFP蛋白，與大麗輪枝菌轉化子能發出綠色熒光的結果一致。

3 討論

本研究將pHMG載體成功轉入到大麗輪枝菌中，獲得了表達綠色熒光蛋白的轉化子菌株，表明MPG1基因可作為大麗輪枝菌遺傳轉化中的新的啟動子，也可能能用于其它真菌的遺傳轉化。MPG1基因是稻瘟病菌的一個表達疏水蛋白的基因，該疏水蛋白參與稻瘟病菌侵染過程中的表面相互作用[12].王教喻等[11]報道MPG1基因作為啟動子能在其源菌株稻瘟菌中轉錄表達GFP基因。相對而言，MPG1基因作為啟動子在其源菌株中可能較易成功驅動基因表達，是否能在其它真菌中驅動基因轉錄表達尚需探索。已有研究表明可用于真菌表達的啟動子不多，主要有gpdA啟動子和trpC啟動子，并且啟動子對不同真菌有一定特異性，如trpC、gpdA啟動子對Hypholoma sublateritium[9];35S啟動子能在真菌平菇中轉錄表達[13],但我們實驗證明35S啟動子不能在大麗輪枝菌中轉錄表達GFP基因（結果未報道）。

因此認為本研究發現MPG1基因可作為大麗輪枝菌遺傳轉化的新的啟動子，并可能能用于其它真菌的遺傳轉化，具有一定的應用價值。