原標題：Avp-iCre轉基因小鼠的鑒定
摘要： 將 Avp - iCre 轉基因首建小鼠傳到 C57BL/6 背景。通過與純合 R OSA26 Cre 報告小鼠交配來檢測iCre（ improved Cre,改進的 Cre 重組酶） 的表達，在子代中研究 β - gal（ beta - galactosidase,β - 半乳糖苷酶）與 AVP（ arginine vasopressin,精氨酸血管加壓素） 的共定位關系。利用 ClockLab 軟件記錄分析 Avp - iCre小鼠跑輪運行行為節律的完整性。實驗結果顯示 β - gal 和 AVP 在 SCN（ suprachiasmatic nucleus,視交叉上核） 的表達存在明顯共定位； Avp - iCre 小鼠具備正常行為節律，其周期為 23. 65 ± 0. 14 h（ Mean ± SD） ,表明該 Avp - iCre 轉基因小鼠可用于近日節律研究。
關鍵詞： 近日節律； Cre; 轉基因小鼠

近日節律是一種以近似 24 h 為周期的節律，起著調控機體生命活動的作用。這種近日節律由生物體內源性的生物鐘所調控。其中哺乳動物下丘腦的 SCN（ suprachiasmatic nucleus,視交叉上核） 是近日節律的中樞振蕩器[1].近日節律光系統將光信號通過 R HT（ retinohypothalamic tract,視網膜下丘腦束） 從視網膜傳遞給 SCN,從而介導光照對生物鐘的相位調整[2].SCN 具有異質性，其神經元表達AVP（ arginine vasopressin,精氨酸血管加壓素） ,VIP（ vasoactive intestinal polypetide,血管活性腸肽） 和GR P（ gastrin releasing peptide,胃泌素釋放肽） 等神經多肽。這些神經元通常處于 SCN 的特定部位，在接受視網膜投射和介導 SCN 鐘功能的輸出方面也存在差異[1].為了進一步理解這些神經元在 SCN相位調整和功能輸出中的作用，單類神經元水平上的操作是必需的。

Cre - LoxP 系統是用來實現組織和細胞特異性基因表達調控的重要實驗手段[3],該技術的應用將為研究 SCN 內特定類型神經元在晝夜節律中的功能提供有力的工具。AVP 是 SCN 中 AVP 能神經元表達的神經肽，主要分布在 SCN 的背側，與 VIP（ 主要分布在 SCN 的腹側） 的表達部位互補。SCN的 AVP 神經元在晝夜節律中起到重要作用[4].iCre（ improved Cre,改進的 Cre 重組酶） 為 Cre 重組酶的一種優化形式，適用于在哺乳動物系統中使用[5].作者在獲取由小鼠 Avp 啟動子驅動表達 Cre 轉基因小鼠（ Avp - iCre） 的基礎上，對該小鼠腦內 iCre 轉基因的表達情況以及轉基因動物的行為節律進行了鑒定。

1 材料和方法

1. 1 實驗所需動物

C57BL /6 WT 小鼠購于武漢大學中南醫院動物中心； Avp - iCre 轉基因首建小鼠由南京大學徐瓔教授贈送，每個基因組含有 2 個 iCre 基因拷貝數。在本實驗中，考慮到轉基因 Cre 在細胞內的表達量通常較低，因此我們利用 R OSA26 這一 Cre 報道小鼠[6]與 Avp - iCre 轉基因小鼠交配，通過對 β - Gal的表達分析間接檢測 iCre 重組酶在腦內的表達。

1. 2 轉基因小鼠基因型鑒定

按《分子克隆實驗指南》制備鼠尾基因組 DNA 作為 PCR 的模板。篩選 Avp - iCre 基因型的引物序列為： AVP - F: GTTCAGCCTTGACTCCAT; AVP - R : ATGTCCAT-CAGGTTCTTCC.篩選 R OSA26 基因型的引物序列為： R OSA - F: AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT; R OSA - R 1:GGAGCGGGAGAAATGGATATG; R OSA - R 2: GCGAAGAGTTTGTCCTCAACC.

1. 3 iCre 重組酶特異性表達

將 Avp - iCre 轉基因小鼠與 R OSA26 小鼠交配，在子代中篩選出 Avp - iCre + / - ; R OSA26 + / -雙陽小鼠，向第三腦室注射 20 ? g Colchicine 秋水仙素（ 溶于2? L PBS 內） ,24 h 后灌流取腦，冰凍切片，然后進行免疫熒光雙標染色。實驗中使用的一抗及其生產公司和使用濃度如下： chicken anti - β- Galactosidase（ Abcam,1: 5000） ,rabbit anti - VIP （ Peninsula,1: 10000） ,guinea pig anti - AVP （ Penin-sula,1: 20000） .二抗為組合使用 Alexa / DyLight488 和 DyLight594 標記的二抗（ Jackson Immuno R e-search） ,濃度均為 1: 500.

1. 4 行為記錄

自由運行行為記錄實驗小鼠均飼養于安裝有轉輪設備的飼養籠中，飼養條件為 DD（ Dark Dark,黑暗的） 環境，動物可自由獲取食物和水。跑輪行為記錄和分析均通過 ClockLab（ Actimetrix） 軟件完成。

2 實驗結果

2. 1 轉基因小鼠基因型鑒定

Avp - iCre 小鼠通過 BAC 轉基因法獲得。如圖 1 所示，5' - 和 3' - 同源臂將 iCre - IER S - LacZ重組到 AVP locus（ AVP BAC number: R P23 -423） ,該載體主要含有 Avp 啟動子元件，iCre 基因序列，內部核糖體結合位點，LacZ 序列，Neo 新霉素抗性基因和 SV40pA 序列等，在 BAC 上替換原有 Avp 基因，并經受精卵的原核注射獲得轉基因小鼠。

Avp - iCre 首建小鼠為 B6CBF1 背景。將該轉基因小鼠回交到 C57BL /6 背景下（ 目前已傳至第 5代） .在回交過程中通過 PCR 法從子代中篩選出 Avp - iCre 陽性小鼠。圖 2 A 所示為 Avp - iCre 引物 PCR 結果： Avp - iCre 陽性條帶大小為676 bp,陰性小鼠則沒有大小為676 bp 的條帶。實驗中我們還將 Avp - iCre 轉基因小鼠與 R OSA26 報告基因小鼠進行交配，通過 PCR 法從子代中篩選出 Avp -iCre + / - ; R OSA26 + / - 雙陽小鼠，用于后續實驗。圖 2 B 為 R OSA 三引物 PCR 結果： C57BL /6 WT為單條約 600 bp 的條帶； R OSA26 + / + 純合小鼠為單條約 300 bp 的條帶； 而 R OSA26 + / - 雜合小鼠則含兩條條帶，一條約 600 bp,另一條約 300 bp.

2. 2 iCre 重組酶時空特異性表達

雖然所獲取的轉基因小鼠含有 LacZ 基因，但前期實驗結果表明其表達量較低，難以通過免疫組化方法檢測。R OSA26 報告小鼠為常用的 Cre 轉基因報告小鼠。因此，為了檢測 Avp - iCre 轉基因小鼠 iCre 重組酶的時空特異性表達，我們將 Avp - iCre 轉基因小鼠與 R OSA26 報告基因小鼠進行交配。

篩選出 Avp - iCre + / - ; R OSA26 + / - 雙陽小鼠，灌流取腦并切片，并對腦片進行 β - gal 和 AVP,β- gal 和 VIP 的免疫熒光雙標染色分析。染色結果（ 圖 3） 顯示： β - gal 信號在 SON 和 PVN 區域與AVP 表達幾乎完全共定位，在 SCN 區與 AVP 表達也存在著明顯的共定位。表明 iCre 基因在轉基因小鼠 SCN AVP 神經元內得以表達，并介導 R OSA26 基因座 loxP 位點間的重組，且有效刪除了 2 個loxP 之間的片段，從而啟動了 LacZ 基因的表達。SCN 區較低程度的共定位可能是因為即使用 Colchi-cine 處理，AVP 在神經元胞體內的表達水平仍然較低。β - gal 和 VIP 免疫熒光雙標染色顯示，SCN表達 VIP 的細胞，并沒有檢測 β - gal 信號。上述結果表明 Avp - iCre 轉基因小鼠 iCre 重組酶的表達有組織特異性且具有活性。

圖 A1,B1,C1 分別顯示的是 AVP 在 SCN 區，SON 區，PVN 區的表達情況； 圖 A2,B2,C2 分別顯示的是 β - gal 在 SCN 區，SON 區，PVN 區的表達情況； 圖 A3,B3,C3 分別顯示的是 AVP 和 β - gal 在SCN 區，SON 區，PVN 區的共定位表達情況。圖 D ~ F 分別顯示的是 VIP 和 β - gal 在 SCN 區，SON區，PVN 區的表達情況，其中 VIP 在 SON 和 PVN 區不表達。圖 G 和 H 分別為圖 A3 和圖 D 的放大效果。白色標尺長度表示100 um. 3V: 3rd ventricle,第三腦室； ox: optic chiasm,視交叉； opt: optic tract,視神經束； SCN: suprachiasmatic nucleus,視交叉上核； PVN: paraventricular nucleus,室旁核； SON: supraop-tic nucleus,視上核。

2. 3 行為記錄分析

共分析了 9 只 Avp - iCre 轉基因小鼠（ 已經回交 4 代） 在全黑環境下的運行節律，利用卡方周期圖分析了其自由運行節律周期為 23. 65 ± 0. 14 h（ Mean ± SD） ,與野生型 C57BL/6 小鼠（ 23. 67 ± 0.17h） 相近[7].圖 4 列舉了一只 Avp - iCre 轉基因小鼠在全黑環境下的跑輪行為記錄（ 共 30 天的記錄結果） ,該小鼠的行為具備正常生物節律。

3 討論

目前，檢測轉基因小鼠中 Cre 重組酶表達的方法較多，如 mR AN 水平上的 R T - PCR 和原位雜交等； 蛋白水平上的免疫組織化學染色等。但這些方法都有各自的缺陷，如 mR NA 水平上能檢測到 Cre基因是否轉錄，但不能確定 Cre 蛋白是否翻譯； 蛋白水平上，Cre 免疫組織化學染色雖然能檢測 Cre 基因的表達部位，但不能確定其是否具有重組酶的活性，且轉基因 Cre 在細胞內的表達量通常較低，Cre抗體特異性效果并不是很好。因此通過 R OSA26 報告小鼠間接驗證可能是目前最好的一種方法。目前普遍使用的 β - gal 抗體特異性好，使用此方法不僅可以對組織進行免疫組化染色確定其表達部位，而且能證明表達的 Cre 重組酶是否具有活性。本實驗利用 Avp - iCre + / - ; R OSA26 + / - 雙陽小鼠，采用免疫熒光雙標分析 β - Gal 和 AVP 的共定位，發現 β - Gal 和 AVP 有明顯的共定位關系，且與 VIP 不存在共定位。這說明，該轉基因小鼠中 Avp 啟動子特異的啟動了 iCre 的表達且具有活性，可用于以后的重組刪除研究工作。

考慮到該 Avp - iCre 轉基因小鼠主要應用于近日節律研究，所以檢測該小鼠的自由運行節律是否正常也是判斷該小鼠可使用性的一個標準。結果顯示該小鼠具備正常的生物節律。